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基于RT-RAA的禽流感H5亚型核酸CRISPR-Cas13a检测方法的建立
1
作者
杨芷翊
王新凯
+4 位作者
史玉婷
付思源
张钰炘
曹琛福
贾伟新
《畜牧兽医学报》
CAS
CSCD
北大核心
2023年第9期3803-3811,共9页
采用逆转录-重组酶介导等温核酸扩增技术(RT-RAA)和成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)检测系统,建立一种快速、高灵敏度和高特异性的禽流感病毒(AIV)H5亚型核酸检测新方法。通过分析342条禽流感病毒H5亚型的HA基因序列,选取保守...
采用逆转录-重组酶介导等温核酸扩增技术(RT-RAA)和成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)检测系统,建立一种快速、高灵敏度和高特异性的禽流感病毒(AIV)H5亚型核酸检测新方法。通过分析342条禽流感病毒H5亚型的HA基因序列,选取保守性区域设计具有强特异性的CRISPR RNA(crRNA)序列以及RT-RAA引物,并对检测体系中的主要成分LwaCas13a蛋白、crRNA、TaqMan探针、T7 RNA Polymerase、NTP Buffer Mix含量进行优化,建立了基于RT-RAA的AIV H5亚型核酸CRISPR-Cas13a检测方法。取105~1 copies·μL^(-1)含有目的基因的质粒标准品和其他亚型禽流感病毒以及其他禽病病毒分别验证和评价该方法的灵敏性和特异性。结果表明,本文设计的RT-RAA引物与crRNA特异且灵敏,其最佳反应体系中主要成分用量分别为LwaCas13a蛋白(60μg·mL^(-1))2.0μL、crRNA(100μmol·L^(-1))3.2μL、TaqMan探针(50μmol·L^(-1))1.28μL、T7 RNA Polymerase 0.25μL、NTP Buffer Mix 2.0μL。该方法检测灵敏度可达1 copy·μL^(-1),且与AIV H3、H6、H7、H9、H10亚型以及NDV、IBV、IBDV、DTMUV无交叉反应。对56份已知的临床样品进行检测,检测结果与荧光定量RT-PCR符合率为98.2%。综上,本研究通过RT-RAA等温扩增技术结合CRISPR-Cas13a基因编辑技术建立了针对AIV H5亚型的快速检测平台,该方法从样本的核酸抽提到获得检测结果的时间控制在1 h 20 min以内,为AIV H5亚型高灵敏度和高特异性的临床快速检测提供了新的技术手段,具有良好的应用前景。
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关键词
H5亚型禽流感病毒
CRISPR
等温扩增
核酸检测
下载PDF
职称材料
禽流感病毒H10N3亚型一步法双重RT-PCR检测方法的建立
2
作者
杨芷翊
王新凯
+5 位作者
柳洋
付思源
张钰炘
史玉婷
曹琛福
贾伟新
《中国兽医科学》
CAS
CSCD
北大核心
2023年第7期811-815,共5页
2021年6月初,我国报道了全球首例H10N3亚型禽流感病毒感染人的事件,该亚型病毒具有跨宿主感染人类的能力,对社会公共卫生安全形成潜在的重大危害,因此,亟须建立一种快速、简便、适用于实验室的H10N3亚型禽流感病毒核酸检测方法。将自GIS...
2021年6月初,我国报道了全球首例H10N3亚型禽流感病毒感染人的事件,该亚型病毒具有跨宿主感染人类的能力,对社会公共卫生安全形成潜在的重大危害,因此,亟须建立一种快速、简便、适用于实验室的H10N3亚型禽流感病毒核酸检测方法。将自GISAID下载的H10N3亚型禽流感病毒HA基因和NA基因序列进行分析比对后,根据其保守区域设计并筛选出2对特异性检测引物,分别对引物浓度、核酸浓度、退火温度、循环数等进行优化,以确定最佳反应条件,建立禽流感病毒H10N3亚型一步法双重RT-PCR检测方法。结果显示,该方法可分别扩增出407 bp和602 bp禽流感病毒H10基因和N3基因的特异性条带,且不与H1N1、H3N2、H6N6、H7N9、H9N2亚型禽流感病毒以及NDV、IBV、IBDV、DTMUV发生交叉反应。该方法灵敏度高,最低检出限为900 pg。在对36份已知的临床样品的检测中,H10N3亚型禽流感病毒阳性率为2.78%,与禽流感H10Nx基因型、Hx N3基因型一步法RT-PCR检测方法以及病毒分离鉴定结果一致,符合率均为100%。上述结果表明,本研究建立的一步法双重RT-PCR方法可以在一次PCR反应中检出H10与N3亚型禽流感病毒混合感染或者单一感染样品,为兽医工作者开展H10N3、H10Nx和Hx N3亚型禽流感的临床诊断和流行病学监测提供了一种简单、有效的分子生物学快速检测方法。
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关键词
禽流感病毒
H10N3
双重RT-PCR
检测方法
原文传递
题名
基于RT-RAA的禽流感H5亚型核酸CRISPR-Cas13a检测方法的建立
1
作者
杨芷翊
王新凯
史玉婷
付思源
张钰炘
曹琛福
贾伟新
机构
华南农业大学兽医学院国家禽流感专业实验室(广州)/广东省人兽共患病防控制剂工程实验室/人兽共患病防控制剂国家地方联合工程实验室/农业农村部人畜共患病重点实验室/广东省动物源性人兽共患病防控重点实验室
深圳海关动植物检验检疫技术中心
出处
《畜牧兽医学报》
CAS
CSCD
北大核心
2023年第9期3803-3811,共9页
基金
广东省科技计划项目(2021B1212030015)
国家现代农业产业技术体系(CARS-41)。
文摘
采用逆转录-重组酶介导等温核酸扩增技术(RT-RAA)和成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)检测系统,建立一种快速、高灵敏度和高特异性的禽流感病毒(AIV)H5亚型核酸检测新方法。通过分析342条禽流感病毒H5亚型的HA基因序列,选取保守性区域设计具有强特异性的CRISPR RNA(crRNA)序列以及RT-RAA引物,并对检测体系中的主要成分LwaCas13a蛋白、crRNA、TaqMan探针、T7 RNA Polymerase、NTP Buffer Mix含量进行优化,建立了基于RT-RAA的AIV H5亚型核酸CRISPR-Cas13a检测方法。取105~1 copies·μL^(-1)含有目的基因的质粒标准品和其他亚型禽流感病毒以及其他禽病病毒分别验证和评价该方法的灵敏性和特异性。结果表明,本文设计的RT-RAA引物与crRNA特异且灵敏,其最佳反应体系中主要成分用量分别为LwaCas13a蛋白(60μg·mL^(-1))2.0μL、crRNA(100μmol·L^(-1))3.2μL、TaqMan探针(50μmol·L^(-1))1.28μL、T7 RNA Polymerase 0.25μL、NTP Buffer Mix 2.0μL。该方法检测灵敏度可达1 copy·μL^(-1),且与AIV H3、H6、H7、H9、H10亚型以及NDV、IBV、IBDV、DTMUV无交叉反应。对56份已知的临床样品进行检测,检测结果与荧光定量RT-PCR符合率为98.2%。综上,本研究通过RT-RAA等温扩增技术结合CRISPR-Cas13a基因编辑技术建立了针对AIV H5亚型的快速检测平台,该方法从样本的核酸抽提到获得检测结果的时间控制在1 h 20 min以内,为AIV H5亚型高灵敏度和高特异性的临床快速检测提供了新的技术手段,具有良好的应用前景。
关键词
H5亚型禽流感病毒
CRISPR
等温扩增
核酸检测
Keywords
avian influenza virus H5 subtype
CRISPR
isothermal amplification
nucleic acid testing
分类号
S852.65 [农业科学—基础兽医学]
下载PDF
职称材料
题名
禽流感病毒H10N3亚型一步法双重RT-PCR检测方法的建立
2
作者
杨芷翊
王新凯
柳洋
付思源
张钰炘
史玉婷
曹琛福
贾伟新
机构
华南农业大学兽医学院
深圳海关动植物检验检疫技术中心
出处
《中国兽医科学》
CAS
CSCD
北大核心
2023年第7期811-815,共5页
基金
国家现代农业产业技术体系项目(CARS-41)
广东省科技计划项目(2021B1212030015)。
文摘
2021年6月初,我国报道了全球首例H10N3亚型禽流感病毒感染人的事件,该亚型病毒具有跨宿主感染人类的能力,对社会公共卫生安全形成潜在的重大危害,因此,亟须建立一种快速、简便、适用于实验室的H10N3亚型禽流感病毒核酸检测方法。将自GISAID下载的H10N3亚型禽流感病毒HA基因和NA基因序列进行分析比对后,根据其保守区域设计并筛选出2对特异性检测引物,分别对引物浓度、核酸浓度、退火温度、循环数等进行优化,以确定最佳反应条件,建立禽流感病毒H10N3亚型一步法双重RT-PCR检测方法。结果显示,该方法可分别扩增出407 bp和602 bp禽流感病毒H10基因和N3基因的特异性条带,且不与H1N1、H3N2、H6N6、H7N9、H9N2亚型禽流感病毒以及NDV、IBV、IBDV、DTMUV发生交叉反应。该方法灵敏度高,最低检出限为900 pg。在对36份已知的临床样品的检测中,H10N3亚型禽流感病毒阳性率为2.78%,与禽流感H10Nx基因型、Hx N3基因型一步法RT-PCR检测方法以及病毒分离鉴定结果一致,符合率均为100%。上述结果表明,本研究建立的一步法双重RT-PCR方法可以在一次PCR反应中检出H10与N3亚型禽流感病毒混合感染或者单一感染样品,为兽医工作者开展H10N3、H10Nx和Hx N3亚型禽流感的临床诊断和流行病学监测提供了一种简单、有效的分子生物学快速检测方法。
关键词
禽流感病毒
H10N3
双重RT-PCR
检测方法
Keywords
avian influenza virus
H10N3
double RT-PCR
method of detection
分类号
S852.659.5 [农业科学—基础兽医学]
原文传递
题名
作者
出处
发文年
被引量
操作
1
基于RT-RAA的禽流感H5亚型核酸CRISPR-Cas13a检测方法的建立
杨芷翊
王新凯
史玉婷
付思源
张钰炘
曹琛福
贾伟新
《畜牧兽医学报》
CAS
CSCD
北大核心
2023
0
下载PDF
职称材料
2
禽流感病毒H10N3亚型一步法双重RT-PCR检测方法的建立
杨芷翊
王新凯
柳洋
付思源
张钰炘
史玉婷
曹琛福
贾伟新
《中国兽医科学》
CAS
CSCD
北大核心
2023
0
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