牛冷冻试管胚胎性别鉴定的应用

利用双引物PCR技术对优质良种牛体外受精的冷冻胚胎进行性别鉴定 ,并对分割后的半胚分别进行PCR扩增和染色体分析 ,两种方法的判定结果相吻合。在本实验条件下 ,利用减少PCR体系中细胞的数量来确立最低的模板DNA的检出量 ,2 细胞不能检测 ,4 细胞检出率为 6 2 .5 % ,8 细胞为 90 % ,1 6 细胞以上为 1 0 0 %。对 2 3枚经过性别鉴定后的胚胎进行移植 ,获得 5头纯种试管牛 ,产犊率为 2 1 7% ,与正常的胚胎移植结果 2 7 3% ( 3 1 1 )无显著差异 ,预测性比为 1 0 0 %符合。

通过体外受精技术缩短绒山羊育种周期的研究

本研究以羔羊卵巢母细胞为材料,把体外受精技术应用到绒山羊育种工作中,观察了羔羊体外受精卵的体外发育及移植产羔的效果,以便探讨通过体外受精技术缩短绒山羊育种周期的技术途径。对406 枚羔羊体外受精卵用M199 + hcG、M199 + LH 和M199 + hcG+ EGF三种培养基进行体外发育培养。结果是,2～4 细胞期胚的发育率平均分别为40-0 % 、43-6 % 和49-6 % ;桑椹胚和囊胚的发育率平均分别为17-5 % 、15-8 % 和18-8 % 。将49 枚F1 代羔羊2～8 细胞期胚移植给31 只受体母羊,结果有11 只妊娠(35-5 % ) 并产羔12 只(F2 代) ;将24 枚F2 代羔羊2～4 细胞期胚移植给15 只受体母羊,结果有2 只妊娠(13-3 % ) 并产F3 代羔羊2 只。

通过体外受精技术缩短绒山羊育种周期的研究

以羔羊卵巢卵母细胞为材料，把体外受精技术应用到绒山羊育种工作中，观察了羔羊体外受精卵的体外发育及移植产羔的效果，以便探讨通过体外受精技术缩短绒山羊育种周期的技术途径．对４０６枚羔羊体外受精卵用Ｍ１９９＋ｈｃＧ、Ｍ１９９＋ＬＨ和Ｍ１９９＋ｈｃＧ＋ＥＧＦ三种培养基进行体外发育培养．结果：２～４细胞期胚的发育率平均分别为４０．０％、４３．６％和４９．６％；桑椹胚和囊胚的发育率平均分别为１７．５％、１５．８％和１８．８％．将４９枚Ｆ１代羔羊２～８细胞期胚移植给３１只受体母羊，结果有１１只妊娠（３５．５％）并产羔１２只（Ｆ２代）；将２４枚Ｆ２代羔羊２～４细胞期胚移植给１５只受体母羊，结果有２只妊娠（１３．

牛体外受精胚胎移植的应用研究

探讨了利用牛 IVF技术 ,在国外生产纯种肉牛胚胎运回国内进行大批量移植后受体母牛的妊娠率及产犊情况 .共移植受体母牛 1 58头 ,妊娠率 ( 90 d)为 2 1 .4 %～ 4 8.5% ,共计产纯种犊牛 55头 .6～ 8日龄胚移植给发情第 7d的母牛能够得到较高的妊娠率 ( 43 .8%～50 .0 % ) ;受体母牛在前两次的移植妊娠率 ( 3 0 .0 %～ 3 5.0 % ) ,明显高于第三次 ( 1 5.4 % )以后的妊娠率 .研究结果证实 ,在国外生产的牛 IVF冷冻胚胎运回国内进行大批量的移植能够获得较高的母牛妊娠率和产犊率 .

小鼠分离胚的培养和移植

将小鼠2—4细胞胚分离成为1/2半胚或2/4半胚后,在体外条件下进行培养,选择发育为桑椹胚、囊胚期的胚胎移植给假孕雌鼠。结果是,分离胚的囊胚发育率在Whitten和BMOC-Ⅲ中分别为88.1％和81.6％,1/2半胚和2/4半胚的发育率分别为89.0％和94.6％(p<0.05),F_1代和ICR1/2半胚的发育率分别为91.7％和49.2％(p<0.01)。在移植1/2半胚和2/4半胚的雌鼠中分别有3只和1只妊娠并产仔鼠2只和1只;在以1/2半胚,去透明带的整胚和保留透明带的整胚为对照移植的三个处理组中其雌鼠的妊娠率和产仔率分别为8.3％和2.8％,30.0％和10.8％,60.0％和36.7％,各处理组间均有显著差异(p<0.01)。

白绒山羊的超数排卵及胚胎移植

本文以PMSG(两种不同剂量)、PMSG-hCG和FSH-LH(两种不同剂量组合)共五种不同处理方法对46只白绒山羊进行超排处理。结果共排卵638枚(平均每只羊13.9枚),回收352枚(平均每只7.7枚)。其中用FSH-LH处理的两个组即连续3天,每天早晚两次,每次注射30国际单位FSH的方法Ⅰ和连续4天分别注射40、70、30、20国际单位FSH的方法Ⅱ效果最好,每只羊的平均排卵数和胚胎回收率分别为16.8,61.7%和18.1,67.7%。将146枚胚胎移植给90只受体羊,结果有69只妊娠,妊娠率为76.7%。其中将2-8细胞胚移植到受体羊输卵管的处理组效果最好,妊娠率达75.0％—100％。

小鼠嵌合体制作技术的研究

本研究采用人工聚合技术,将小鼠不同品系和同品系之间的8细胞胚聚合为一体,分别用PBS+FCS、BWW和BMOC-Ⅲ培养20—24小时后观察了发育率。其结果在昆明白←→C57中分别有88.1％(59/67)、95.0％(115/121)和94.8％(73/77),在昆明白←→昆明白中分别有93.3％(28/30)、87.7％(121/138)和86.7％(52/60)的嵌合胚发育为桑椹胚或胚泡,各处理组之间无显著差异。将141枚嵌合胚分别移植给12只受体,结果有7只小鼠妊娠共产仔25只。在昆明白←→C57的17只嵌合体小鼠中毛色为黑、白和杂色的各有3、4和10只。

羔山羊卵巢卵母细胞体外成熟培养条件的研究

将出生后５０～７０日龄的羔山羊，经超数排卵处理后，从卵泡中抽取卵母细胞，取外观形态正常的卵母细胞分成五组，在含有１０％胚牛血清（ＦＣＳ）的ＴＣＭ－１９９培养液中分别经１２、１６、１８、２０和２４ｈ的体外成熟培养后进行体外受精，探索不同体外成熟培养时间对体外受精及卵裂率的影响，另外，在成熟用培养基内还分别添加了发情母羊血清（ＥＮＧＳ）和ＦＣＳ以观察其次培养效果，结果表明，经过１２～２４ｈ体外成熟培养

绵羊体外受精卵冷冻解冻后的移植

以含有10％乙二醇的磷酸缓冲液对体外受精的绵羊桑椹胚及囊胚进行防冻和冷冻处理后保存于液氮中。解冻后将胚胎分别以去除防冻剂后移植和连同防冻剂直接移植两种方法,将30枚桑椹胚和19枚囊胚先后以外科手术法移植到28只受体母羊子宫内。结果共有8只受胎,其中4只足月妊娠后产羔4只(♀1,♂3),另外4只分别在移植后2～3个月妊娠中断,其原因尚不清楚。解冻后连同防冻剂直接移植后的受胎率为50％(4/8),明显高于去除防冻剂后移植的结果20％(4/20),(P<0.05)。受体的发情同步化程度不同(-1～+1日)对受胎率无明显影响。

羔山羊卵泡的发育及卵母细胞体外成熟的研究

为利用羔羊作供胚羊，采用三种超数排卵的方法，对出生后４０－１５０日龄的羔山羊进行超数排卵处理以后，从活体采集卵巢卵母细胞在体外进行了培养，研究结果表明，采用超数排卵的技术能够诱导未性成熟羔山羊的卵巢卵泡的发育，由超排后采集到的羔山羊卵泡母细胞经体外培养有继续发展成熟的能力，适宜的超排方法为ＦＳＨ１０ｍｇ＋ＬＨ１．５ｍｇ（肌肉注射），羔山羊适宜的超排日龄为４０－９０ｄ，卵母细胞的体外适宜培养时间为１

绒山羊胚胎的体外培养,冷冻保存和移植的研究

要用体外培养和冷冻保存的方法将超排处理后的绒山羊２￣８细胞期胚胎经体外在Ｍ１９９＋ＦＣＳ（对照组）、Ｍ１９９＋ＯＥＣ＋ＦＣＳ、Ｍ１９９＋ＯＥＣ＋ＥＮＧＳ和Ｍ１９９＋ＯＥＣ＋ＮＳＳ的培养基中分别进行培养以后，选取发育为桑椹胚和早期囊胚期胚胎分别以１０％Ｇｌｙ、１０％ＥＧ为防冻剂和玻璃化方法进行冷冻保存，并将用常规和玻璃化法冷冻保存的胚胎解冻后进行移植。结果表明，体外培养胚胎的囊胚的发育率在四个培养处

大小鼠异种间嵌合胚的培养和移植

本研究观察了大小鼠异种间嵌合胚在体外 培养条件下以及移植后的发育情况。采用聚合法使Wistar-Imamichi大鼠和ICR小鼠的早期胚胎聚合为一体,然后用于体外培养,并进行移植。实验结果表明,大小鼠异种间嵌合胚在含20％FCS的Whitten溶液中有80.8％的胚可发育为囊胚期胚胎。这种胚胎在受体大鼠和小鼠,均能着床,着床率分别为51.3％和53.7％,没有显著差异。着床后的胚胎能够维持到妊娠第10天左右,但以后很快退化、死亡,其原因有待进一步探索。

小鼠嵌合体制作技术的研究

本文着重探索了能够使同品系或不同品系小鼠间8细胞胚胎聚合为一体并发育为桑椹胚、囊胚的有效方法和培养条件。方法是将采自昆明白和C57品系小鼠的8细胞胚胎,在含有0.5%链霉蛋白酶的PBS溶液中进行去透明带处理后,用植物血球凝集素P（PHAP）为接合剂,以1+1的组合在V型塑料多孔板的孔底达到聚合。聚合胚培养于液体石蜡油覆盖下的培养液微小滴中,在37℃、5%CO2的培养箱内培养20～24h,以桑椹胚或囊胚的发育率为指标,比较三种不同的培养基即PBS+FCS。BWW和BMOC-Ⅲ对嵌合胚发育的影响。其结果是,在昆明白←→C57聚合胚中分别有88.1%（59/67）,95.0%（115/121）和94.8%（73/77）,在昆明白←→昆明白中分别有93.3%（28/30）,87.7%（121/138）和86.

小鼠分离胚的培养和移植

以小鼠2～4细胞胚为材料,进行分离、培养和移植试验,探索通过早期胚的分离技术获得一卵双胎或多胎动物的可能性。方法是先将胚胎在含链霉蛋白酶的溶液中去透明带,然后移到不含Ca2+、Mg2+的EDTA溶液中并用吸管轻微吹打,使每个胚胎分为1/2半胚或1/4半胚,然后移至培养液微小滴中,在37℃、5%CO2培养箱内培养72小时,并根据发育为正常囊胚为指标观察了不同的培养基、不同胚龄以及动物品种间对分离胚发育的影响。在部分实验中还将发育为桑椹胚、囊胚的分离胚移植给假孕小鼠观察了产仔情况。结果是。

清洁级Wistar-Imamichi大鼠的保种与繁育管理

从日本引进的Wistar-Imamichi大鼠,经四年多的扩大繁殖已近万只。对其四年内的生长与繁育指标进行测定,其结果与原种对照,在性成熟早,个体差异小,性周期稳定,性格温顺,产仔数和仔鼠出生体重等方面基本与原种保持一致。但妊娠率,分娩率,仔鼠离乳体重方面比原种略有降低。

屠宰母牛卵巢卵母细胞体外受精与发育的研究

将从屠宰母牛卵巢采得的卵母细胞用含有LH或hCG的M199培养24～26小时,然后用经钙离子载体Ionophore A23187诱导获能的牛新鲜或冷冻精子进行授精处理。授精6～7小时后再用含有乳酸钠和EDTA的M199培养至48～60小时后观察受精及受精卵的发育情况。结果表明,卵子的受精率及受精卵的发育率与卵母细胞成熟用培养基、授精用精子(新鲜或冷冻)以及供卵牛的品种均有关系。将用含有hCG的M199培养成熟的卵子,以获能处理过的新鲜精子授精后,其受精率和受精卵子中单精子受精并发育为2～8细胞期胚的比率在蒙古牛为91.4％(265/200)和19.6％(52/265),在黑白花奶牛为69.7％(62/89)和4.8％(3/62)。

蔗糖、牛血清白蛋白和锌离子对白绒山羊精液冷冻效果的影响

在传统的甘油—卵黄—柠檬酸盐稀释液的基础上，Ｂ液内分别添加了３种浓度的蔗糖、牛血清白蛋白（ＢＳＡ）、锌离子进行分析比较。结果表明，添加蔗糖的保护液较传统的保护液能更有效地冻存精液，１００ｍＭ组精子活力显著提高（Ｐ＜０．０５）。ＢＳＡ和锌离子对精液冻存无显著影响（Ｐ＞０．０５），但都具有一定的保护作用。改良稀释液的精子活力比传统稀释液的提高３２．７％（Ｐ＜０．０１）。细管精液的冻存效果显著高于颗粒精液（Ｐ＜０．０５）。用最佳组合的细管精液对１２５只母羊进行人工授精，情期受胎率为６３．１％。

屠宰母牛卵巢卵母细胞的体外受精与早期发生

将采自屠宰母牛卵巢的未成熟卵子在含有促性腺激素和牛血清的TCM199或Ham'sF10内培养成熟后,再用以钙离子载体Ionophore A23187诱导获能的牛新鲜或冷冻精子进行授精处理,6～7小时后移入发育用培养液,即含有牛血清及丙酮酸钠的M199或Ham's F10内继续培养。在授精48小时及60～96小时后分别统计了培养卵子的受精率及受精卵的卵裂率。在部分实验中把发育为4～8细胞期的胚移入经假孕处理过的母兔输印管内培养4～5天或者在原发育培养液内继续培养5～8天之后观察了桑椹胚、囊胚的出现率。结果是培养卵子的受精率及受精卵的卵裂率分别达92.0～97.8％和62.5～67.6％,移入兔输卵管内和在体外条件下继续培养的卵子中分别有3.7～30.8％和4.3～31.0％(发育为外形正常的桑椹胚～囊胚期胚胎(包括扩张囊■及■化囊胚)。

山羊手术法胚胎移植对供受体母羊重复使用的影响

采用手术法对白绒山羊进行胚胎移植，探讨手术对供受体母羊重复使用的影响．结果：１９９１～１９９４年４年中，用于第１、２、３、４次超排（ＦＳＨ＋ＬＨ）的有效供体母羊数为９１只、４３只、７只和２只，手术取胚的胚胎回收率分别为７０．１％、８２．７％、７９．６％和６３．６％．供体母羊手术取胚后，在下１～２情期中发情时进行人工授精，用于第１、２、３、４次手术后人工授精的所有组合的供体母羊数为１３６只、５９只、１６只和３只，分娩率分别为５２．２％、３７．３％、４６．７％和６６．７％．用于第１、２、３、４次手术移植的受体母羊数为２４４只、８５只、４５只和９只，移胚后分娩率分别为６８．４％、６１．２％、６４．４％和３３．３％．经统计学检验表明：手术次数对供体母羊超排后的胚胎回收率及其术后１～２情期中人工授精的妊娠分娩率无影响．受体母羊第１、２、３次手术移胚的分娩率之间无差异，但显著高于第４次手术受体母羊的分娩率（Ｐ＜０．０５）．

绵羊体外成熟、体外受精卵的体外发育及移植后的产羔

体外成熟、体外受精后的绵羊卵在体外长期培养或在2～4细胞期和桑堪～囊胚期移植给受体母羊,观察了培养卵的发育和移植后的受胎率。方法是将采自屠宰场的绵羊卵巢在1～12小时内带回实验室,抽取卵母细胞。从中选取卵丘细胞层完整的卵子,在二氧化碳培养箱内,用含有10％NSS(或FCS)、hCG和E_2,并以Hepes缓冲的M199培养24～26小时。再用以IonophoreA23187诱导获能处理过的新鲜公羊精于进行体外受精.7～10小时后移入发育培养基,即含有10％FCS(或NSS)和丙酮酸钠的Hepes缓冲的M199内继续培养,受精后将部分发育为2～4细胞胚和桑堪～囊胚期胚手术移植给受体母羊。另一部分卵子则在受精后48～72小时的不同时间内统计其卵裂卵的出现率,并继续培养7～12天详细观察卵裂卵的发育情况。在受精后48～72小时卵裂卵的出现率,FCS和NSS组分别为39.6％145/366)和52.4％(182/347),前者显著低于后者;将61枚2～4细胞期胚和桑椹～囊胚期胚分别移植给20只受体母羊,有10只受胎。共产羔11只,受胎率为50％;在发育培养液内继续培养的482枚卵裂卵中有312枚(64.7％)发育为桑椹～囊胚期胚(其中包括部分孵化囊胚)。