Schwann细胞与其培养纯化

Schwann细胞是周围神经系统的主要功能细胞 ,兼有迁移、粘着、产生细胞外基质、形成髓鞘 ,参与周围神经修复的功能和分泌多种神经因子、生物活性物质 ,促进神经元、神经胶质细胞存活、抑制其凋亡的功能。

大鼠发育不同时期各级卵泡凋亡的观察

目的 :观察研究不同阶段大鼠卵巢卵泡的生长发育与卵泡凋亡的关系、凋亡过程及规律。方法 :用DNA缺口原位末端标记检测法 ,对生后 2 0～ 140d不同阶段大鼠卵巢卵泡的生长发育及卵泡凋亡进行了光镜观察。结果 :生后 2 0d鼠卵泡即可见到凋亡发生 ,卵泡凋亡始于卵母细胞 ,继则是与其相邻的卵泡细胞 ,卵泡细胞的凋亡从内向外依次发生。卵泡的凋亡数目随着卵巢的生长发育而逐渐增多 ,生后 4 0d可见到黄体凋亡发生 ,至 50～ 60d可见到卵泡膜内膜细胞凋亡及白体形成 ,出生 80d后卵巢发育已完全成熟 ,此时卵泡的凋亡数也达到了高峰。结论 :卵泡凋亡见于观察的各阶段 ,生后 80d达高峰。

构建Neuregulin1克隆载体的实验

目的:Schwann细胞具有促进神经元再生的作用,Neuregulin1(NRG1)具有促进神经元再生和Schwann细胞增殖的效应,构建NRG1克隆载体,可为下一步建立NRG1转染的Schwann细胞系,对神经损伤模型进行Schwann细胞移植,观察其对神经损伤的修复作用提供重要实验方法。方法:实验于2003-09/2004-01在哈尔滨医科大学医学遗传学研究室完成。提取幼龄大鼠脑RNA,反转录聚合酶链反应,用XbaⅠ和EcoRⅠ对目的基因和载体质粒进行双酶切,T4连接酶连接Schwann后转化Top10感受态大肠杆菌,挑取LB(Amp+)平板生长克隆菌摇菌扩增,用菌液扩增聚合酶链反应检测目的基因,同时提取质粒与空载体并列电泳验证克隆质粒,进行克隆载体测序。结果:获得一株NRG1克隆质粒,测序结果显示为NRG1新的异构体,用基因组DNA和cDNA为模板扩增聚合酶链反应验证是NRG1新的剪切体。结论:构建的NRG1克隆异构体是大鼠NRG1基因克隆载体,可用于进一步的细胞转染、蛋白表达功能检测和细胞移植研究。

许旺细胞提取与纯化的新方法(英文)

背景:许旺细胞移植可改变损伤局部的微环境,有利于神经创伤的修复,获取大量高纯度、具有增殖活性的许旺细胞是研究的关键。目的:探求一种简单且快速提取和纯化许旺细胞的方法。方法:实验组大鼠在无菌条件下切断坐骨神经远端,使坐骨神经在体内预变性;对照组大鼠的坐骨神经不予任何处理。术后7d切取两组坐骨神经,采用混合酶消化、组织块移植法提取许旺细胞;通过低酶消化、2次接种差速贴壁法分离纯化许旺细胞。相差显微镜下观察细胞形态,并行免疫荧光染色鉴定;计算细胞纯度;MTT法检测细胞增殖能力。结果与结论:实验组培养第7天可见典型呈双极或三极的许旺细胞,细胞间建立连接;对照组细胞突起较短,与周围细胞较少关联。S-100免疫荧光染色后,细胞呈阳性绿色表达。实验组细胞增殖较快,第15天迅速形成漩涡状,成纤维细胞数量相对较少,细胞纯度达96.1%;对照组细胞在培养过程中增殖较缓慢,成纤维细胞数量多,细胞纯度较低。MTT法检测结果显示,原代培养时两组许旺细胞增殖能力均较弱;传代后与对照组比较,实验组许旺细胞增殖能力明显增强(P<0.05或0.01),第三四代达峰值。结果证实体内预变性、体外混合酶消化、组织块移植结合低酶消化、双差速贴壁分离许旺细胞是一种简便、快速的提取纯化许旺细胞的方法。

生后大鼠发育不同时期各级卵泡凋亡的观察

目的:观察研究生后不同阶段大鼠卵巢卵泡的生长发育与卵泡凋亡的关系、凋亡过程及规律,探索性激素血液浓度变化与卵泡凋亡的内在联系。方法:用DNA缺口原位末端标记检测法,对生后20—140天不同阶段大鼠卵巢卵泡的生长发育及卵泡凋亡进行了光镜观察,同时对生后各阶段鼠血液孕激素(progesterone P、卵泡刺激素(follicleslimulating hormone FSH)、黄体生成素(luteinizing hormone LH)、雌二醇(estradiol E2)浓度进行放免检测。结果:生后20天鼠卵泡即可见到凋亡发生,卵泡凋亡始于卵母细胞,继则是与其相邻的卵泡细胞,卵泡细胞的凋亡从内向外依次发生。卵泡的凋亡数目随着卵巢的生长发育而逐渐增多,生后40天可见到黄体细胞凋亡发生,至50—60天可见到卵泡膜内膜细胞凋亡及白体形成,出生80天后卵巢发育已完全成熟,此时卵泡的凋亡数也达到了高峰;放免结果经方差分析显示孕激素P>0.05,差异显著,推测其浓度变化与卵泡凋亡有内在联系。

受精15天人胚一例光镜观察

1 材料和方法受精15天人胚一例,取自妊娠合并子宫肌瘤切除术患者,剖开子宫腔,宫体侧壁可见直径约1.2cm的囊状隆起,剪开囊壁,早期胚位于囊内,呈白色细线状.结合末次月经日期,测量胚长度2mm,固定于10%甲醛溶液中,石蜡包埋,整体连续切片厚5μm,HE染色,光镜观察.2 结果15天人胚绒毛膜主要由细胞滋养层和合体滋养层细胞组成,少数绒毛中可见胚外中胚层,个别绒毛中轴内可见内皮细胞围成的毛细血管,血管腔内未见血细胞(图1).此时,三胚层胚盘已形成(图2).内胚层细胞呈立方状,核圆,清晰可辨,其边缘与卵黄囊相连.卵黄囊壁内侧由单层立方上皮围成,近腔面偶见圆球形,体积较大,嗜酸性染色的原始生殖细胞;壁外侧紧贴单层立方上皮可见由胚外中胚层分化的单层。

3～20周人胚和胎儿肾小体的组织发生

应用光、电镜对3～20周22例人胚和胎儿肾小体的组织发生进行了观察.受精后第25天胚肾已有肾小体发生.随着胚龄的增长,肾小体的发生数目增多,肾小体的形成方式是:胚肾内先形成许多厚壁小管,在一部分厚壁小管的诱导下,另一部分厚壁小管的一侧壁呈帽状增厚,分化形成造血干细胞、毛细血管内皮及肾小囊脏层,对侧壁形成肾小囊壁层.即厚壁小管的双侧壁形成肾小体.

家兔肝脏注射乙醇、沸盐水后损伤范围及程度的对比观察

用100℃盐水与乙醇作为介入疗法的介质对家兔经腹壁穿刺进行肝脏注射，对比观察二者对肝脏损伤的范围及程度。实验结果显示，100℃盐水与乙醇作用相同，可致肝组织坏死。但同等剂量100℃盐水较乙醇对肝组织损伤的范围小，对坏死灶周围肝组织累及的范围亦小，损伤的程度也明显较乙醇轻。提示：100℃盐水可取替乙醇作为介入疗法的介质，既可杀伤肿瘤细胞，又可使正常肝组织的损伤降低到最小范围。

15-56天人胚心脏组织发生的光镜观察

目的：观察人胚心脏的组织发生。方法：15-16d7 例人胚用10 的甲醛固定，石蜡包埋，常规染色，整体连续切片，光镜观察。结果：15d 见心脏形成。25d 心脏已发生，心室位于心房头端，房、室壁厚薄等同，肌性室间隔开始形成。妊娠33d， 心脏已转至正常解剖位置，第二房间隔正在发生，同时可见已形成的第一隔与第二孔；房、室瓣开始形成。妊娠35d 左右球嵴出现，至45、 46d 左右嵴向中线生长；第二房间隔形成完毕，卵圆孔出现。妊娠56d ，室间孔关闭，左、右心室完全分隔；主、肺动脉隔形成，主、肺动脉完全分隔；房室瓣、动脉瓣发育成形。结论：至妊娠第八周末，心脏初具成体规模。

启发式教学法在组胚教学中的应用

启发式教学，要求教师讲课要不断地启发学生思考，井把讲解和思考有机地结合起来，引导学生边学边想，发现问题、分析问题和解决问题。学习发展了思维能力，思考又促进了学习，使学与思既相辅相成，又相互促进。下面笔者浅谈在组织胚胎学中运用启发式敦学的几点尝试。

5—20周人胚胎肾小体的组织发生

作者对5—20周18例胎儿肾脏肾小体的发生进行了光镜观察。观察所见,5周胚肾已有肾小体发生,肾内的间充质首先分化成造血干细胞,在造血干细胞的诱导下形成毛细血管及肾小囊。7周后胚肾小体由皮质深层向浅层逐渐发生,其肾小体是由双厚壁小管形成。

人胚造血干细胞与毛细血管发生关系的探讨

通过光镜对1例35天人胚毛细血管发生及造血干细胞与毛细血管发生关系进行了观察与研究。结果揭示:各器官内的毛细血管是由器官本身的间充质细胞分化形成;造血干细胞对毛细血管的发生有重要的诱导作用。

射线工作者外周血淋巴细胞微核的观察

本文通过射线工作者外周血淋巴细胞微核率的观察,说明辐射可导致细胞内染色体损伤。经统计学分析,微核率可随工作年限的延长而升高,有显著的统计学意义。

大白鼠脾窦的胚胎发生

本文观察了大白鼠脾窦内皮细胞胚胎发生中的起源及形态演变过程。脾窦来源于睥脏本身的间充质细胞。最初脾窦为连续型的毛细血管,内皮细胞椭圆形,细胞间可见紧密连接,继之内皮细胞转变成梭形,最后形成长杆状,内皮细胞间呈间断的连接,缺乏连接处出现裂孔,孔处无基膜封闭,内皮外基膜不完整,发育成典型的栅栏状。

不同年龄段大鼠骨髓基质干细胞生物学特性的比较

背景:骨髓基质干细胞取材方便,增殖力强,具有多向分化潜能,且可自体移植,是组织工程中理想的种子细胞。年龄等因素对骨髓基质干细胞生物学特性的影响鲜见报道。目的:比较不同年龄段大鼠骨髓基质干细胞生物学特性的差异,为临床细胞移植提供实验依据。方法:骨髓基质干细胞供体为SD大鼠。按细胞来源分为3组,即幼年组、成年组和老年组。无菌条件下剪断大鼠股骨两端,用含体积分数为10%胎牛血清的DMEM培养液冲洗骨髓腔,收集骨髓冲洗液,吹打制成单细胞悬液,通过200目的筛网滤过后将其置于培养瓶中培养。取第2代生长均一的细胞,CD44,CD29,CD90免疫荧光鉴定;观察细胞形态及黏附速度;细胞计数,绘制生长曲线;MTT法检测3组细胞的增殖活力。结果与结论:CD44,CD29,CD90免疫染色细胞呈阳性;幼年组骨髓基质干细胞的黏附速度快于成年组和老年组;细胞增殖幅度明显(P<0.05);MTT法测定结果显示幼年组骨髓基质干细胞活力强,与另外两组比较差异具有显著性意义(P<0.05)。提示幼年SD大鼠骨髓基质干细胞增殖快、活力强、可在短时间内大量扩增,是理想的组织工程细胞。

瓦勒变性坐骨神经段对大鼠BMSCs向SCs分化的影响

目的:通过观察瓦勒变性坐骨神经段对大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)增殖、分泌功能以及向施万细胞(Schwann cells,SCs)分化的影响,探讨其在BMSCs向SCs分化中的作用及可能的机制。方法:采用全骨髓贴壁法分离、培养SD大鼠BMSCs,并采用免疫荧光法鉴定。应用Transwell建立坐骨神经段与BMSCs双层培养体系,将实验分为瓦勒变性坐骨神经段与BMSCs联合培养组(A组)、正常坐骨神经段与BMSCs联合培养组(B组)和BMSCs单独培养组(C组)。倒置相差显微镜观察联合培养过程中BMSCs形态变化;免疫荧光染色检测联合培养第7天各组BMSCs表达S-100情况;联合培养第0、1、4、7、11、14天,利用细胞计数法绘制各组BMSCs生长曲线,ELISA法检测各组培养液上清中神经生长因子(nerve growth factor,NGF)含量,实时荧光定量PCR检测各组BMSCs中S-100 mRNA表达情况。结果:成功分离培养BMSCs,免疫荧光鉴定BMSCs呈CD29、CD44和CD90表达阳性。联合培养第7天倒置相差显微镜观察可见,A组BMSCs胞体回缩,呈梭形,并带有突起,形态类似SCs;B、C组大部分BMSCs形态无明显变化。联合培养第7天免疫荧光染色示,A、B、C组BMSCs S-100阳性表达率分别为31.1%±2.9%、16.2%±1.7%和0.42%±0.07%,A组阳性表达率明显增高(P<0.05)。各组BMSCs生长曲线均近似"S"形,从第4天开始,A组BMSCs增殖速度明显快于B、C组(P<0.05);ELISA法检测示,A组NGF含量呈时间依赖性增加,于联合培养第7天达高峰,随后呈下降趋势。B、C组NGF含量随共培养时间延长有所增加,但显著低于A组(P<0.05);实时荧光定量PCR检测示,联合培养第4、7、11、14天,A组S-100 mRNA表达明显高于B、C组(P<0.05)。结论:瓦勒变性坐骨神经段能有效促进大鼠BMSCs增殖并诱导BMSCs向SCs样细胞分化,联合培养过程中NGF可能参与BMSCs向SCs分化的调控。

大鼠脊髓楔型半切空洞模型的建立及评估

目的建立一种新型大鼠脊髓半切模型,为临床脊髓空洞损伤研究提供适宜的动物模型。方法 25只SD大鼠随机分为脊髓楔型块状半切组(A组,n=10)、假手术组(B组,n=10)和正常对照组(C组,n=5)。术后采用BBB运动功能评分、斜板试验、HE染色和核磁共振(MRI)检测综合评价脊髓半切模型的稳定性。结果术后A组大鼠伤侧后肢BBB运动功能评分及斜板维持最大角度值显著低于B组和C组(P<0.05),而这些指标在B组和C组之间没有明显差异;术后28 d HE和MRI检测显示脊髓损伤区(A组)灰质和白质发生明显的形态学改变。结论通过该方法建立的脊髓半切模型稳定、可靠,适于脊髓空洞性损伤的研究。

坐骨神经瓦勒变性大鼠许旺细胞生物学特性及分泌功能变化

背景:研究表明外周神经损伤后,许旺细胞在基底膜管内形成Bunger带,引导再生轴突延伸,但具体作用机制目前尚不清楚。目的:观察大鼠坐骨神经损伤后瓦勒变性对许旺细胞生物学特性及分泌功能的影响。方法:建立大鼠坐骨神经横切模型,分为坐骨神经瓦勒变性组(坐骨神经横断组)和手术对照组。采用神经段单酶消化法分离培养许旺细胞,光镜下观察细胞形态变化,S-100免疫荧光鉴定。取第1代许旺细胞,利用计数法绘制14 d内许旺细胞的生长曲线,MTT法检测14 d内许旺细胞增殖活性,酸性磷酸酶法检测许旺细胞黏附能力,ELISA法检测神经生长因子浓度。结果与结论:坐骨神经段培养第14天,坐骨神经横断组神经段边缘可见大量许旺细胞,呈线形排列;手术对照组许旺细胞数量少,呈散在分布,两组许旺细胞S-100均呈阳性表达。许旺细胞传代培养第3天,两组许旺细胞均进入对数增长期,随时间延长,细胞数及细胞增殖吸光度值均呈上升趋势,坐骨神经横断组细胞数及增殖吸光度值明显高于手术对照组(P<0.05);坐骨神经横断组许旺细胞黏附能力明显高于手术对照组(P<0.05);ELISA法检测示,坐骨神经横断组神经生长因子浓度在培养第4,6,8,10,12,14天时均高于手术对照组(P<0.05)。结果表明大鼠坐骨神经损伤后两三周,瓦勒变性对许旺细胞生物学功能具有显著影响,可诱导许旺细胞幼稚化,促使许旺细胞在短期内迅速分裂增殖,并分泌大量神经营养因子及细胞外黏附成分,为再生轴突的延伸提供适宜的神经微环境;并增加细胞黏附能力,为外周神经损伤修复提供适宜的神经微环境。

芦荟大黄素联合氟尿嘧啶对人胃癌细胞增殖及凋亡的影响

目的探讨芦荟大黄素(AE)与5-氟尿嘧啶(5-FU)体外协同作用及对人胃癌细胞增殖及凋亡的影响。方法 MTT法检测药物对细胞增殖抑制作用;光镜观察细胞生长状态,计数细胞分裂指数;电镜观察药物对细胞超微结构的影响;TUNEL法检测细胞凋亡。结果 AE单独应用对细胞的增殖抑制作用弱,与5-FU合用明显抑制细胞生长,呈剂量依赖性;药物作用48 h后,联合用药组细胞分裂指数显著降低,可见大量细胞皱缩,胞膜界限模糊,核膜消失,核质浓缩及凋亡小体形成;TUNEL法分析显示,联合用药组细胞凋亡率为(69.4±4.1)%,与AE组(〔15.7±1.9)%〕、5-FU组〔(33.5±2.8)%〕比较差异显著(P<0.05)。结论 AE与5-FU联合应用能有效抑制胃癌细胞增殖,促进细胞凋亡,二药具有协同增效作用。

大鼠两种脊髓半切模型制备方法的改良及比较

目的 比较两种大鼠脊髓半切模型制作方法的各自特点及其应用,为临床脊髓损伤研究提供适宜的动物模型.方法 60只SD大鼠随机分为脊髓半横切组（A组,n=20）、脊髓楔型块状半切组（B组,n=20）和正常对照组（C组,n=20）.术后采用BBB动功能评分、斜板实验、HE染色和MRI检测综合评价两种脊髓半切模型的稳定性.结果 术后A组和B组大鼠伤侧后肢BBB运动功能评分及斜板维持最大角度值显著低于C组（P＜0.05）,而这些指标在A组和B组之间没有明显差异;术后28dHE和MRI检测示A组和B组间脊髓损伤区组织结构具有显著差异.结论 脊髓半横切与脊髓楔型半切法均可建立稳定、可靠的脊髓半切伤模型,而脊髓楔型半切模型更适于评价移植物治疗脊髓损伤的研究.