首批百日咳杆菌鼠源抗血清国家参考品的制备和标定

目的制备和标定百日咳杆菌鼠源抗血清国家参考品。方法按《中华人民共和国药典》2015版(三部)(简称《中国药典》)相关要求,制备候选百日咳杆菌鼠源抗血清参考品(简称候选参考品),以WHO百日咳杆菌鼠源抗血清标准品(编号97/642)为标准,组织3家单位进行协作标定,并采用热加速试验对候选参考品进行稳定性观察。结果共制备合格候选参考品300支,其外观、水分、分装精度均符合《中国药典》的相关要求;协作标定结果显示,室内和室间几何变异系数(geometric coefficient of variation,GCV)均低于20%;经统计学分析,最终确定候选参考品中含PT-Ig G、FHA-Ig G、PRN-Ig G分别为95 IU/m L、917 IU/m L、102 IU/m L,95%可信区间分别为91.7~103.7 IU/m L、900.2~944.5 IU/m L、99.4~106.1 IU/m L;每支安瓿分别含PT-Ig G 19 IU、FHA-Ig G 183 IU、PRN-Ig G21 IU;候选参考品于-20℃放置15个月及37℃放置7 d、14 d、21 d和28 d后,各种百日咳组分抗体的酶标单位值均变化不大,差异均无统计学意义(P>0.05)。结论首批百日咳杆菌鼠源抗血清国家参考品均符合《中国药典》的各项要求,且一致性、稳定性良好,可用于百日咳组分疫苗小鼠效力血清学方法的质量控制评价。

白喉类毒素酶联免疫检测法的建立及初步应用

目的建立测定吸附无细胞百白破联合疫苗中白喉类毒素酶联免疫检测（ELISA）方法,并进行验证及初步应用。方法以高效价兔抗DT多克隆抗体和相应酶标抗体建立双抗体夹心ELISA法,确定线性范围同时验证该方法的重复性和特异性等确定检测限度,并初步应用。结果 DT含量在0-0.0160 Lf/m L范围内反应曲线线性关系良好（r〉0.99）。该方法与破伤风类毒素（Tetanus toxoid,TT）、百日咳毒素（Pertussis toxin,PT）、百日咳丝状血凝素（Filamantous hemagglutinin,FHA）与黏着素（Pertactin,Prn）无明显交叉反应,重复性好、特异性较强,精密度及准确度验证均符合常规质控要求,通过验证确定的准确检测范围为0.000 8-0.016 0 Lf/m L;检测限度为0.000 8 Lf/m L。该方法对DT抗原进行了吸附率的检测,同时检测了10批白喉类毒素原液与《中华人民共和国药典》三部2010年版规定的絮状单位检测方法进行对比,变异系数低于20%。结论建立了白喉类毒素双抗体夹心ELISA检测方法,为吸附无细胞百白破联合疫苗生产过程中白喉类毒素含量的质量控制提供了有效技术手段。

百日咳丝状血凝素酶联免疫检测法的建立

目的建立百日咳组分疫苗丝状血凝素(FHA)抗原含量监控的ELISA检测法。方法制备的多克隆抗血清,经辛酸硫酸铵法纯化抗体,用过碘酸钠氧化法辣根过氧化物酶标记,以棋盘滴定法确定最佳包被抗体及酶标抗体的浓度配伍,建立了双抗体夹心ELISA检测法。结果对双抗体夹心ELISA法的特异性、最佳线性范围、检测限度、精密度、准确度、测定限量、适用性的一系列验证试验表明,该方法与百日咳组分疫苗中PT和Prn无明显交叉反应,特异性较好。在0至20 ng/mL测量区间有最佳线性,相关系数大于0.99;经实验内12次及不同试验间3次测定16、8、4 ng/mL中的FHA含量,变异系数在0.2%～11.4%间,回收率在96.9%～114.5%间,精密度及准确度验证均符合常规质控要求,因此测定限量为4 ng/mL。结论该方法能有效检测出百日咳杆菌培养上清中的FHA含量,可用于百日咳组分疫苗生产过程的中间品质量控制。

火箭免疫电泳法检测ACYW135群脑膜炎球菌多糖疫苗多糖含量和分子大小的初步验证

目的对火箭电泳法用于检测ACYW135群脑膜炎球菌多糖疫苗的多糖含量和多糖分子大小进行验证。方法用化学法和火箭电泳法分别检测ACYW135群脑膜炎球菌多糖疫苗的多糖含量和多糖分子大小,统计学分析两种方法的检测结果。结果两种方法的检测结果差异无统计学意义。结论火箭电泳法可以用于检测ACYW135群脑膜炎球菌多糖疫苗的多糖含量和多糖分子大小。

检测四价脑膜炎球菌多糖疫苗中A群多糖含量ELISA法的建立

目的建立双抗体夹心ELISA法,对A群流脑多糖抗原进行特异性定量测定。方法制备抗A群多糖的特异性多克隆抗体,所得抗血清经辛酸-硫酸铵沉淀法纯化后,用过碘酸钠法制备辣根过氧化物酶标记多克隆抗体。分别以抗A群多糖多克隆抗体作为包被抗体及酶标二抗,建立双抗体夹心ELISA法,优化反应条件,对A群多糖抗原进行特异性定量测定。结果一系列验证试验表明,该法特异性较好,未检出与C、Y、W135群多糖的交叉反应;1.25～20 ng/mL多糖浓度范围的剂量反应曲线线性最佳,相关系数大于0.98,经实验内10次及不同试验间以16、84、ng/mL测定3次A群多糖中的含量,变异系数在6.3%～11.5%间,回收率在91.8%～105.9%之间,符合常规质控要求,检测限量为4 ng/mL。采用该法测定3批ACYW135群四价脑膜炎球菌多糖疫苗中A群多糖含量、分子大小及回收率的结果均符合规程草案质量标准。结论建立的双抗体夹心ELISA法可尝试用于ACYW135群脑膜炎球菌多糖疫苗中A群多糖的关键质量指标的检测。

百日咳黏附素等电点全柱成像毛细管等电聚焦电泳检测方法的建立及验证

目的 建立百日咳黏附素(pertactin,PRN)等电点(isoelectric point,pI)全柱成像毛细管等电聚焦电泳(whole column imaging detection-capillary isoelectric focusing,WCID-CIEF)检测方法,并进行验证。方法 通过优化检测PRN抗原WCID-CIEF过程中的聚焦时间、样品终浓度等参数,建立测定PRN抗原的WCID-CIEF方法,并对方法进行专属性、准确性、重复性、中间精密度、耐用性及批间一致性验证。结果 PRN抗原pI WCID-CIEF测定方法的最佳聚焦时间为1 500 V预聚焦1 min,3 000 V聚焦3 min;体系中PRN抗原最佳终浓度为300μg/mL。PRN抗原pI约为6.035,样品缓冲液在抗原各峰位置无干扰峰,方法的专属性、准确性、重复性、中间精密度、耐用性及批间一致性均良好。结论 建立的WCID-CIEF方法适用于PRN抗原的pI检测及电荷异质性分析,可为PRN抗原的表征提供依据以及相关疫苗研发和生产过程中的质量控制提供参考。

吸附无细胞百(三组分)白破联合疫苗内毒素定量检测方法的建立及验证

目的建立吸附无细胞百日咳(三组分)-白喉-破伤风联合疫苗﹝diphtheria, tetanus and acellular pertussis (three components) combined vaccine, adsorbed, DTacP﹞内毒素含量的定量检测方法, 并对其进行验证。方法采用动态显色法(美洲鲎试剂)检测DTacP的内毒素含量, 并对该方法的线性与范围、专属性、准确度、中间精密度、重复性、定量限进行验证, 并与凝胶法结果进行比较。结果动态显色法的线性相关系数的绝对值大于0.99;DTacP稀释100倍和1 000倍, 对试验均无干扰作用;3批DTacP内毒素检测结果的准确度回收率分别为56%、75%、80%, 重复性的变异系数分别为5.59%、7.14%、5.81%;不同操作人员在不同时间检测3批DTacP中内毒素结果的变异系数分别为15.93%、8.48%和7.43%;将光密度反应阈值30毫吸光度单位增减3毫吸光度单位, 耐用性的相对偏差均小于15%。DTacP中内毒素含量检测的定量限为30内毒素单位(endotoxin unit, EU)/ml。动态显色法检测3批DTacP中内毒素含量的检测结果与凝胶法结果一致, 均小于限定值200 EU/ml。结论建立了定量检测DTacP中内毒素含量的动态显色法, 该法具有良好的线性、专属性、准确度、中间精密度以及重复性, 可用于DTacP中内毒素含量的定量检测。

第1代百日咳毒素国家参考品的标定

目的标定第1代百日咳毒素国家参考品。方法以WHO第1代百日咳毒素国际参考品JNIH-5为标定标准品,组织6个实验室采用CHO细胞簇集试验的方法对百日咳毒素候选参考品C1进行协作标定,并给予国际单位值。由中国食品药品检定研究院通过CHO细胞簇集试验对4和37℃放置7、14、21、28 d的C1进行热加速稳定性检测,-20℃放置36个月的C1进行实时稳定性检测,将C1用不同稀释液(水、PBS、50%甘油)复溶,于4、-20、-80℃分别放置1、7及14 d,检测复溶稳定性。结果 C1经6个实验室的协作标定获得104个有效结果,最终确定候选参考品簇集活性为3 000 IU/支。C1的纯度、外观、水分、无菌、分装精度均合格,与JNIH-5的抗原抗体结合能力差异无统计学意义(P>0.05),具有良好的实时稳定性、热加速稳定性,C1经50%甘油复溶后2周内稳定性较好。结论该候选参考品符合国家参考品的各项要求,可用于百日咳毒素CHO簇集试验及组分百日咳疫苗原液抗原纯度、安全性和免疫原性的检测。

检测百日咳毒素活性的中国仓鼠卵巢细胞簇集法的建立和初步应用

目的 建立检测百日咳毒素（pertussis toxin,PT）活性的中国仓鼠卵巢（Chinese hamster ovary,CHO）细胞簇集法,并将建立的方法应用于无细胞百日咳疫苗生产的质量控制.方法 将PT标准品系列稀释后与培养的CHO细胞混合,观察PT引起CHO细胞簇集的敏感度,并研究反应时间、反应溶液的pH值、缓冲液浓度、加样顺序等因素对PT引起CHO细胞簇集的影响.应用建立的方法检测百日咳疫苗生产过程中脱毒前后的PT活性及丝状血凝素和百日咳黏着素组分中残留的PT活性.结果 PT使CHO细胞发生最佳簇集的理想反应时间是24h,最适pH值是7～8,适宜氯化钠缓冲液浓度为0.15 mol/L,最优加样顺序是先加CHO细胞再加PT.建立的CHO细胞簇集法的检测敏感度为10pg/ml PT,且重复性良好.结论 CHO细胞簇集法可用于PT活性检测.

疫苗用氢氧化铝佐剂的质量研究

目的 建立与国际标准一致的氢氧化铝佐剂的质量标准。方法 制备10批疫苗用氢氧化铝佐剂，按照中国药典2015年版进行外观、氯化钠含量、渗透压摩尔浓度、氢氧化铝含量、pH值的检测。参照欧洲药典第8版开展溶解度和内毒素含量检测，鉴别试验、沉降试验、无菌检查、牛血清白蛋白吸附力试验以及氯化物、硫酸盐、硝酸盐、铵盐、铁盐、砷盐、重金属等7项杂质13个检测项目的测定。参照丹麦铝佐剂对粒径、比表面积、等电点、黏度和抗原吸附率进行检测。对检定结果进行统计分析，初步确定与欧洲药典相关联的质量标准。结果 10批氢氧化铝佐剂的外观、无菌试验、内毒素含量、溶解度、鉴别试验、沉降试验、牛血清白蛋白吸附力、杂质和抗原吸附率的检测结果均合格。佐剂的氯化钠含量均值为1.01%，渗透压摩尔浓度均值为309 mOsmol/kg，氢氧化铝含量均值为4.7 mg/ml；佐剂灭菌前、后的pH值均值分别为6.3、5.8；佐剂的粒径DV50全部〈10 μm；平均比表面积为1 386 m^2/kg，等电点为10.3，黏度为1.2 mPa·s。检测结果均符合质控合格范围。结论 初步建立了符合欧洲药典第8版的氢氧化铝佐剂质量控制标准。

脑膜炎球菌W135群多糖含量和分子大小双抗体夹心ELISA检测方法的建立及初步应用

目的建立检测A、C、Y、W135群脑膜炎球菌（Neisseria meningitidis,Nm）多糖疫苗（Groups A,C,Y,W135 menig-nococcal polysaccharide vaccine,MPV4）中W135群多糖含量和分子大小的双抗体夹心ELISA法,并进行初步应用。方法以抗W135群Nm多克隆抗体作为包被抗体,建立双抗体夹心ELISA法,采用棋盘滴定法筛选包被抗体与酶标抗体的最佳工作浓度,对W135群Nm多糖进行特异性定量测定,并验证线性关系的重复性;对建立的ELISA法进行特异性、准确度、精密度及定量限的验证;采用建立的ELISA法检测10批W135群Nm多糖样品和10批无关流脑多糖样品,进行W135群Nm多糖的鉴别试验;采用建立的ELISA法测定MPV4多糖含量、多糖分子大小和回收率。结果经棋盘滴定法确定双抗体夹心ELISA法的最佳包被抗体工作浓度为10μg/ml,最佳酶标抗体工作浓度为1∶15 000稀释,W135群Nm多糖在2.5~20 ng/ml浓度范围内剂量反应曲线线性关系良好,相关系数大于0.99。采用建立的双抗体夹心ELISA法检测W135群Nm多糖为强阳性,检测其余样品的结果均为阴性;试验内及试验间测定16、8、4 ng/ml W135群Nm多糖含量的变异系数在1.1%~9.0%之间,回收率在87.5%~105.0%之间,定量限为4 ng/ml;检测W135群Nm多糖的阳性符合率和无关多糖的阴性符合率均为100%。采用该法测定3批MPV4中W135群多糖含量、分子大小及回收率均符合申报MPV4疫苗暂行规程关于W135群Nm多糖的质量标准。结论建立的双抗体夹心ELISA法可用于MPV4中W135群多糖含量和分子大小的测定。

检测百日咳黏着素的酶联免疫吸附法的建立及初步应用

目的 建立定量检测白喉-破伤风-无细胞百日咳疫苗生产过程中黏着素（pertactin,Prn）的方法.方法 纯化的Prn免疫家兔以制备高效价血清抗Prn抗体.辛酸-硫酸铵沉淀法纯化抗Prn多克隆抗体并进行辣根过氧化物酶标记,建立双抗体夹心ELISA法.结果 建立的方法与丝状血凝素和百日咳毒素无交叉反应,特异性较好.该ELISA法在1.25 ～ 80.00μg/L Prn测量区间有最佳线性,相关系数＞0.99.实验内和实验间检测64.0、32.0、16.0 μg/L Prn,变异系数为2.6％～7.7％,回收率为84.9％～ 95.5％,精密度和准确度均符合常规质控要求,因此该法的定量限度为16.0 μg/L.结论 建立的ELISA法可有效检测百日咳疫苗纯化过程中的Prn含量,为组分百日咳疫苗质量控制奠定了重要基础.

检测百日咳毒素的双抗体夹心ELISA法的建立

目的建立白喉-破伤风-无细胞百日咳疫苗生产中百日咳毒素（pertussistoxin，PT）含量的测定方法。方法免疫家兔制备高效价抗胛血清，纯化抗肼多克隆抗体并进行酶标记，建立双抗体夹心ELISA法并对其进行验证。结果建立的方法在0～20ng／mlPT测量区间呈现最佳线性，相关系数〉0．99，且重复性好。检测百日咳丝状血凝素和黏着素，结果均为阴性，说明该法特异性良好。试验内10次、不同试验问3次测定16．0、8．0、4．0、3．0ng／mlPT，变异系数为2．8％～9．7％，回收率为95．7％～106．O％，精密度和准确度验证均符合常规质量控制要求，定量限度为3．0ng／ml。结论该方法能有效检测百日咳杆菌大罐发酵过程中分泌的门，为门质量控制奠定了重要基础。

检测破伤风类毒素的酶联免疫吸附法的建立及应用

目的建立定量检测白喉-破伤风-无细胞百日咳疫苗生产过程中破伤风类毒素（tetanustoxoid，TT）的方法。方法TT免疫家兔以制备高效价血清抗TT抗体。辛酸一硫酸铵沉淀法纯化抗TT多克隆抗体并进行辣根过氧化物酶标记，建立双抗体夹心ELISA法。结果建立的ELISA法与丝状血凝素、百日咳毒素及白喉类毒素无交叉反应，特异性较好。该ELISA法在0．5～16．0Lf／LTT检测区间有最佳线性，决定系数〉0．99。实验内和实验间检测14．0、12．0、6．0、3．0和1．5Lf／LTT，变异系数为4．7％～9．8％，回收率为92．7％～109．0％，精密度和准确度均符合常规质控要求。该法的定量下限为1．5Lf／LTT。结论建立的ELISA法可有效检测破伤风疫苗纯化过程中的TT含量，为破伤风疫苗质量控制奠定了基础。

检测百日咳抗原的系列酶免疫测定试剂盒的稳定性及其在百日咳疫苗生产中的应用

目的 评估检测百日咳毒素（pertussis toxin,PT）、丝状血凝素（filamentous haemagglutinin,FHA）和黏着素（pertactin,Prn）的3种酶免疫测定试剂盒的稳定性及其在无细胞百日咳疫苗（acellular pertussis vaccine,aPV）生产质量控制中的应用.方法 对3种酶免疫测定试剂盒进行热加速试验（37℃放置3 d）和长期稳定性试验（4℃放置6月）,根据试剂盒的标准曲线相关系数、最高浓度标准品与阴性对照的吸光度值之比（P/N）值、质控品回收率评估试剂盒的稳定性.将3种试剂盒用于aPV生产的发酵、纯化、吸附阶段的PT、FHA、Prn定量检测,以确定3种试剂盒对aPV生产质量控制的可行性.结果 3种酶免疫测定试剂盒的37℃热加速试验和4℃长期稳定性试验的各项质量参数均符合相关要求.采用试剂盒定量各生产阶段的百日咳抗原含量显示：百日咳杆菌的发酵终点在第42～46 h;各3批PT、FHA和Prn组分液的纯化回收率分别为49.24％、56.12％和63.65％,68.75％、55.60％和49.76％、75.73％、60.63％和50.10％.采用单独吸附的铝佐剂抗原吸附率高于采用混合吸附,但单独和混合吸附方式制备的疫苗的效力无差异.结论 检测PT、FHA和Prn的3种酶免疫测定试剂盒具有良好的稳定性,可用于aPV生产的质量控制.

测定脑膜炎球菌疫苗C群多糖的双抗体夹心ELISA法的建立

目的建立测定A、C、Y、W135群脑膜炎球菌多糖疫苗（groupsA，C，Y，W135meningococ—calpolysaccharidevaccine，MPV4）C群多糖含量的双抗体夹心ELISA法。方法制备抗C群多糖多克隆抗体，所得的多克隆抗体经辛酸一硫酸铵沉淀法纯化后，用过碘酸钠法对其标记辣根过氧化物酶。分别将抗C群多糖多克隆抗体作为包被抗体和酶标二抗，建立双抗体夹心ELISA法，优化反应条件，对C群多糖进行特异性定量测定。结果建立的双抗体夹心ELISA法特异性较好，未检出与A、Y、W135群多糖的交叉反应。c群多糖在2．5～20．0rig／ml质量浓度范围的剂量反应曲线线性最佳，相关系数大于0．99。该法的准确度和精密度均较好，试验内和试验间变异系数和多糖回收率分别为0．6％～9．1％和87．5％～100．0％，定量限度为4．0ng／ml。采用该法测定3批MPV4显示，C群多糖含量及多糖分子大小K值和回收率的测定结果均与先前的测定结果一致，均符合暂行质量标准。结论建立的双抗体夹心ELISA法可用于MPV4C群多糖的关键质量指标测定。

检测脑膜炎球菌多糖疫苗Y群多糖含量和分子大小的双抗体夹心ELISA法的建立和初步应用

目的建立测定A、C、Y、W135群脑膜炎球菌多糖疫苗（groupsA，C，Y，W135meningococ—calpolysaccharidevaccine，MPV4）Y群多糖含量的双抗体夹心ELISA法。方法采用杂交瘤技术制备抗Y群多糖单克隆抗体，并通过过碘酸钠法用辣根过氧化物酶标记单克隆抗体。分别以抗Y群多糖不同位点的单克隆抗体作为包被抗体和酶标二抗，通过优化反应条件来建立双抗体夹心ELISA法，同时进行方法学验证。结果建立的双抗体夹心ELISA法特异性良好，未检出与A、C、W135群多糖的交叉反应。Y群多糖在2．5～20．0ng／ml范围的剂量反应曲线呈现最佳线性关系，相关系数〉0．99。该法的试验内和试验间准确度较好，精密度较佳，定量限度为4ng／ml。采用该法测定3批MPV4Y群多糖显示，Y群多糖的含量、多糖分子大小‰值和回收率的结果均与先前的检定结果一致，符合暂行质量标准。结论建立的双抗体夹心ELISA法可用于MPV4Y群多糖的关键质量指标测定。

人用疫苗氢氧化铝佐剂吸附力的质量控制初探

目的 建立氢氧化铝佐剂吸附力的相关质控方法.方法 对3批国产氢氧化铝佐剂与丹麦铝佐剂（Alhydrogel）同时进行粒径、比表面积、零电荷点的测定,并比较两种佐剂对不同浓度牛血清白蛋白（bovine serum albumin,BSA）及百日咳丝状血凝素（filamentous hemagglutinin,FHA）的吸附力.结果 测定显示,3批国产铝佐剂50％体积百分比（DV50）的粒径分布分别为4.49、5.83和6.28 μm;比表面积分别为1 602、1 093和1 014 m^2/kg;零电荷点分别为10.2、10.3和10.2.丹麦铝佐剂DV50的粒径为4.58 μm,比表面积为2 230 m^2/kg,零电荷点为8.5.3批国产和1批丹麦铝佐剂（5 g/L）对2 g/L BSA的吸附率分别为98.69％、99.41％、99.72％和98.04％,均符合欧洲药典的吸附力合格标准.国产和丹麦铝佐剂（1.3 g/L）对50～1 000 mg/L FHA的吸附率均在97％以上.结论 根据对国产氢氧化铝佐剂相关质量指标的研究,初步建立了氢氧化铝佐剂吸附力的质控标准.