AAV介导的TNFR关节内基因治疗对血友病性关节病预防和治疗的实验研究

血友病性关节病(HA)的发病机制与关节内炎性细胞因子过表达有关,肿瘤坏死因子α(TNFα)是最重要的炎性因子之一。可溶性肿瘤坏死因子受体(sTNFR)作为TNFα的受体可以特异性地与TNFα结合拮抗TNFα炎性效应。为探讨关节腔内持续表达sTNFR对HA关节的保护作用,将表达TNFR的质粒(pAAV-TNFR:Fc)包装为rAAV5-TNFR:Fc载体,注射到血友病小鼠膝关节内。结果显示炎症持续42 d后,关节内仍能表达TNFR:Fc,两个给药组中TNFα和白介素-1β(IL-1β)的表达不同程度地下降,关节病变均显著减轻,表明该关节内基因治疗对血友病性关节病有预防和治疗效果。

槲皮苷铜配合物作为P-糖蛋白抑制剂的研究

P-糖蛋白(P-gp)是细胞产生多药耐药的主要原因之一,寻找有效的P-gp抑制剂是逆转P-gp介导的细胞多药耐药性的重要方法之一。以具有微弱P-gp抑制活性的天然槲皮苷为配体,合成了槲皮苷铜(Cu-Quercitrin)和槲皮苷锌(Zn-Quercitrin)配合物。结果表明,Cu-Quercitrin能提高P-gp的底物罗丹明123(Rh123)和抗癌药物阿霉素(DOX)在耐药细胞中的累积,同时增强了DOX的细胞毒性,表明Cu-Quercitrin可以抑制P-gp的活性,且优于常见的抑制剂维拉帕米;Cu-Quercitrin对P-gp蛋白水平表达并没有影响,只是减少了细胞中腺苷三磷酸(ATP)的含量。这一研究结果表明结构多样、配体丰富的金属配合物有望成为有效的P-gp抑制剂。

来那度胺对血友病性关节炎的治疗作用研究

目的:探讨来那度胺对人滑膜成纤维细胞(HFLS)增殖的影响以及对A型血友病小鼠血友病性关节炎(HA)的治疗效果。方法:以HFLS为模型细胞,在细胞培养基中添加柠檬酸铁和TNF-α重组蛋白,体外模拟炎性环境,加入不同浓度的来那度胺,通过CCK-8、ELISA、RT-q PCR、流式细胞术等方法检测HFLS的增殖能力、促炎细胞因子释放和细胞凋亡等功能的变化;构建小鼠HA模型,关节腔内注射不同浓度(0.1、0.3和1.0 g/kg)的来那度胺,在给药后d 14收集样本,通过RT-q PCR检测和组织学方法观察小鼠关节中滑膜增厚、新生血管形成等情况。结果:在体外,与未加药物的对照组相比,来那度胺0.001、0.01、0.1、1、10μmol/L均能够显著抑制HFLS的增殖活力(P<0.05),以浓度为0.01μmol/L时作用最显著(P<0.001)。与对照组相比,来那度胺能够显著抑制HFLS细胞TNF-α、IL-1β、IL-6和IFN-γ等炎性因子的表达水平(P<0.05)。流式细胞术检测结果表明,来那度胺能够促进HFLS细胞的凋亡水平(P<0.05)。RT-q PCR结果表明来那度胺能够显著降低小鼠关节组织中TNF-α、IL-1β、IL-6、MCP-1和VEGF的mRNA表达水平(P<0.05)。组织学病理检测结果表明,来那度胺能够明显降低HA小鼠的关节滑膜厚度,减少新生血管生成,效果呈现剂量依赖性(r=-0.9129),以剂量为1 g/kg时保护作用最明显。结论:在体外,来那度胺能够有效抑制HFLS细胞增殖,促进其凋亡,并抑制其炎性因子的表达;在体内,能够缓解小鼠关节内炎症发展,显著降低小鼠关节中炎性因子的表达水平,为来那度胺将来应用于HA的临床治疗提供了理论和实验依据。

绒山羊胎儿成纤维细胞和成体干细胞体外生长特性的比较

本研究旨在探索阿尔巴斯白绒山羊成体干细胞和胎儿成纤维细胞体外生长、增殖能力和胚胎干细胞特性的差异,为成体干细胞的应用提供新的理论基础。研究以胎儿成纤维细胞(fetal fibroblast cells,FFCs)作为对照,检测阿尔巴斯白绒山羊3种成体干细胞,脂肪间充质干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)、骨髓间充质干细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)和肌肉卫星细胞(muscle-derived satellite cells,MDSCs)中多能性(NANOG,OCT4,SOX2)、增殖(TERT,PCNA)、凋亡(P53,BAX)基因的转录和表达。表明g ADSCs、g BMSCs和g MDSCs低表达NANOG、OCT4和SOX2,与g FFCs没有明显差异;TERT在g BMSCs和g MDSCs中的表达量高于g FFCs中的表达量,而在g ADSCs中的表达量则低于g FFCs;PCNA和BAX在g FFCs和g MDSCs中高表达,在g ADSCs和g BMSCs中低表达;P53在g BMSCs中的相对表达量较高,在g FFCs、g ADSCs和g MDSCs中的相对表达量均较低。现象表明,在一定程度上成体干细胞的胚胎干细胞特性及增殖能力优于胎儿成纤维细胞。

大鼠骨髓间充质干细胞培养、鉴定与成胰岛样β细胞诱导

为治疗糖尿病寻找新的胰岛β细胞替代物,该研究对大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)进行了体外分离培养、鉴定及成胰岛样β细胞诱导。应用全骨髓离心贴壁培养法分离大鼠BMSCs,进行培养、传代、表面标志物检测,利用DMSO和高糖环境对BMSCs进行胰岛样β细胞诱导。结果显示,大鼠BMSCs体外培养细胞形态呈成纤维细胞样,可以稳定传代;CD13、CD44和CD106表达呈阳性,CD49d呈阴性。在成胰诱导条件下,BMSCs可形成胰岛样圆形细胞团,双硫腙染色呈棕红色,PDX1(pancreatic duodenal homeodomain 1)、CK19(cytokeratin 19)、巢蛋白、胰岛素免疫组化染色均呈阳性;经RT-PCR检测发现,成胰诱导后的BMSCs中表达胰岛素、PDX1和glucagon基因;经q-PCR检测发现,成胰诱导后的BMSCs中胰岛素m RNA水平是大鼠胰腺成体干细胞(pancreas adult stem cells,PASCs)的1.09倍(P>0.05);同时,有相应量的胰岛素合成。结果表明,分离得到大鼠BMSCs体外生长稳定,能转分化为胰岛样细胞,该研究结果为糖尿病治疗提供了新的实验依据。