蛋白质结构建模的后期优化策略

以Lip8为研究对象,以分级开放式优化和组合优化为优化策略,分别采取四种不同的优化手段对相同的初始模型进行了优化,同时比较了含水体系与不含水体系的优化过程,最终获得8个相应优化后的蛋白模型.采用Procheck,Errat,Profile 3D及Ramachandran图等方法对上述8个模型进行评估.通过比较各项评估结果,研究了不同优化方法对最终模型准确性的影响,结果表明,优化过程中采用分级开放式策略,同时考虑显性溶剂(水)体系和加入分子动力学优化的优化方法可以获得相对最优结构.

γ-聚谷氨酸产生菌的筛选及发酵条件

从土壤中筛选分离到一株高产γ?聚谷氨酸的菌株PGAN?12,经鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis),在含谷氨酸钠和葡萄糖的培养基中可生成大量γ?聚谷氨酸,缺少谷氨酸钠和碳源均不能合成γ?聚谷氨酸.PGAN?12合成γ?聚谷氨酸的合适碳源为葡萄糖,而TCA循环中的有机酸包括柠檬酸均不能使PGAN?12合成γ?聚谷氨酸.最适氮源是酵母膏.PGAN?12是谷氨酸依赖型的γ?聚谷氨酸产生菌,在谷氨酸钠浓度为70g/L时,γ?聚谷氨酸取得最大产量18.32g/L,但在谷氨酸钠浓度为30g/L时,获得了最大的表观转化率62.1%,此时生成γ?聚谷氨酸为14.2g/L.

γ-谷氨酰转肽酶产生菌的筛选和培养条件的研究

从土壤中筛选分离到一株产γ 谷氨酰转肽酶的菌株 ,经生理生化特性鉴定为枯草芽孢杆菌 (Bacillussubti lis)NX 2。产酶条件研究表明 ,葡萄糖是最佳的碳源 ,酵母膏为最佳氮源 ,当采用 1 5 %酵母膏 ,1 0 %玉米浆复合氮源 ,菌体产γ 谷氨酰转肽酶活力达到 3 2U mL。分析NX 2菌生长和产酶的进程 ,发现γ 谷氨酰转肽酶的合成与菌体生长是同步的。

利用Pichia pastoris生产S-腺苷甲硫氨酸的发酵工艺

在摇瓶中考察了重组Pichia pastoris发酵的诱导剂量,L-甲硫氨酸,以及pH对腺苷甲硫氨酸产量的影响。放大到3.7 L发酵罐和30 L发酵罐后,研究了重组细胞的发酵过程变化,对S-腺苷甲硫氨酸初步纯化。摇瓶中优化后的发酵条件是:每天添加1%甲醇诱导,L-甲硫氨酸为50mmol/L,培养基pH 5.0。培养144 h后SAM产量达到2.32 g/L。3.7 L发酵罐中发酵251 h后细胞浓度为120 g/L,SAM总量为15.18 g。放大到30 L发酵罐中,发酵225.5 h后细胞浓度约为120 g/L,SAM总量为145.05 g。纯化后SAM的纯度为93.5%,回收率为84.5%。

应用细胞透性化技术快速提取氧化葡萄糖杆菌胞内右旋糖酐糊精酶

将细胞透性化技术应用到右旋糖酐酶的提取检测过程中,根据单因素实验和正交试验设计确定了从氧化葡萄糖杆菌（Gluconobacter oxydans）细胞中提取胞内右旋糖酐糊精酶（DDase）的最佳方法：甘氨酸（Gly）质量分数15%,Triton X-100体积分数1%,菌悬液OD600为0.5~6.0,pH为6.81,冰浴处理时间1 h,透性化试剂的提取效率可达到酶活最大值的90%以上。与超声波细胞破碎法相比,该方法条件温和,酶的释放率较高并易于大量试样的平行实验操作。

糠醛及其衍生物微生物降解(转化)研究进展

对糠醛及其衍生物微生物降解(转化)机制进行了系统性阐述,介绍了一些代表性的降解(转化)菌株的驯化和筛选、降解(转化)途径及应用等。并且对糠醛及其衍生物的生物降解(转化)进一步研究的方向提出了看法。

离子交换法分离D-天冬氨酸和L-丙氨酸

对离子交换法分离D-天冬氨酸和L-丙氨酸的工艺条件进行了研究。综合考虑树脂对D-天冬氨酸和L-丙氨酸的吸附容量及相对选择系数,选择了一种适合该体系分离的树脂—XH-1,并对吸附条件及洗脱条件进行了研究,确定了最佳工艺条件,为今后工业应用提供一定的依据。

贻贝足蛋白fp-5在大肠杆菌中的表达、修饰与功能分析

将地中海贻贝足蛋白fp-5与不同细菌来源的酪氨酸酶在大肠杆菌中共表达,通过体内修饰获得性能改善的贻贝足蛋白。在对序列分析和密码子优化的基础上,分别构建包含酪氨酸酶与贻贝足蛋白基因的单载体和双载体共表达系统,以实现其在大肠杆菌中表达。纯化后的蛋白通过NBT/Gly染色试验和酸-硼酸盐差异光谱法分析,表明fp-5发生了不同程度的羟基化修饰,其中fp-5与来源于多刺疣微菌(Verrucomicrobium spinosum)的酪氨酸酶(TyrVs)共表达得到的5-Vs质量浓度为18.6 mg/L,修饰率达到55.20%,黏附力约为未修饰fp-5的4.6倍。与体外修饰贻贝足蛋白相比,TyrVs体内修饰得到的5-Vs具有广泛的羟基化水平以及优秀的附着力和黏附力,为生物医药等领域提供了一种有潜力的生物胶材料。

4-戊基苯酚单克隆抗体的制备及其可变区的同源建模

目的制备4-戊基苯酚(4-AP)单克隆抗体(mAb),通过分子生物学方法对其可变区cDNA克隆和同源建模,为4-AP单链抗体制备及抗体分子层面改造奠定基础,同时为4-AP的免疫学检测提供一种新方法。方法将免疫小鼠脾脏细胞与Sp2/0细胞融合,筛选出F10阳性单抗细胞株。通过其mRNA的抽提,克隆出可变区cDNA序列,利用生物软件进行同源建模和分子对接。结果在最适条件下,其间接竞争ELISA(ic-ELISA)公式为y=A_2+(A_1-A_2)/(1+(x/x_0)~p)(A_1=1.28;A_2=-0.07;x_0=12 560.75;p=0.74),相关系数(R^2)为0.997,其最低检测限为0.65μg/mL。mAb重链和轻链分别属于IgG1型和Kappa型,其与4-AP的结合力为氢键和疏水作用。结论成功制备出1株稳定分泌的4-AP mAb的杂交瘤细胞株。通过同源建模对抗体可变区空间结构进行深入研究,为单链抗体及抗体改造提供参考,同时为4-AP含量检测提供新方法。

通过分析来自Pyrococcus abyssi的腈水解酶中带电基团位置变化探讨蛋白耐热机制

蛋白含带电侧链基团的氨基酸的位置对蛋白质的热稳定性有很大的影响,目前,往往采用蛋白质结构模型"静态"分析这一影响。本文以1株耐热的腈水解酶作为研究对象,构建并异源表达了该酶,对其酶学性质进行初步分析。利用Discovery Studio对该酶进行同源建模,得到空间结构。将此空间结构利用Gromacs软件在不同温度下进行分子动力学(MD)模拟,使用Macrodox软件计算蛋白质所有带电氨基酸残基的包埋率与溶剂可接触性面积(SA),发现在不同温度下,部分氨基酸带电基团的SA值会发生显著变化。说明通过静态分析并不一定能够得到非常准确的结果,而应进行动态分析。

产唾液酸酶微生物的筛选及产酶条件的优化

以无单唾液酸四己糖神经节苷脂(GM1)的神经节苷脂为唯一C源,从土壤中筛选出1株能以多唾液酸神经节苷脂为底物,转化生成GM1的产唾液酸酶微生物,经鉴定为溶黄嘌呤厄菌(Oerskovia xanthineolytica)。利用单因素法和响应面分析法对溶黄嘌呤厄菌产生唾液酸酶的条件进行优化,酶活提高了4.89倍。利用优化后培养条件,以神经节苷脂混合体为底物,经过微生物生物转化后,单唾液酸神经节苷脂GM1的含量从10%提高到83.7%。

基于长链底物亲和的脂肪酶MAS1理性设计改造

探讨了脂肪酶MAS1对长链底物4-硝基苯酚豆蔻肉酸酯(pNP-C14)催化的最适温度、最适pH、pH稳定性,并通过分子动力学模拟计算得出结合自由能,然后根据结合自由能的差值初步筛选出了G145W及T141L两个单点突变体。实验表明,与野生型MAS1相比,结合自由能降低显著的突变体G145W的米氏常数(Km)减小了11%,催化常数(kcat)与Km的比值(kcat/Km)为野生型MAS1的1.29倍,突变体G145W对长链底物的亲和能力和催化效率均有提高;而结合自由能降低较小的突变体T141L的Km值增大了22%,kcat/Km为野生型MAS1的0.88倍,说明酶与底物分子结合自由能的降低并非准确的突变筛选标准。通过分子力学/广义波恩表面积(MM/GBSA)残基拆解分析得出:残基T38、F39、L149、F153、V202、V233对脂肪酶活性口袋与长链底物结合的稳定性贡献较其他残基大;残基T38、G40、N41、N45和T237对提高长链底物的亲和能力具有重要贡献,预测为热点残基,其结合自由能的降低可以作为突变筛选的参考标准。

反相高效液相色谱法对大鼠体内菲达司他的药代分析

建立反相高效液相色谱（RP—HPLC）测定大鼠血浆中菲达司他浓度的方法，在此基础上对菲达司他在大鼠体内的药代动力学进行初步研究。菲达司他的血浆样品利用乙酸乙酯提取法进行处理，色谱检测条件为用安捷伦Zorbax Eclipse XDB C18色谱柱，紫外检测波长200nm，流动相中v（水）：v（甲醇）为72．28，流速1mL／min，柱温30℃。建立的RP—HPLC法线性范围为0．8～400ug／mL（R=0．9997）。提取回收率大于95％，日内、日间精密度相对标准差（RSD）小于2％。本法简便、准确，适用于菲达司他药代动力学的研究；菲达司他在大鼠体内的药代动力学过程二室模型．

红鳍东方鲀组织蛋白酶L表达载体的构建及表达结果验证

红鳍东方鲀味道鲜美,已从其体内发掘了系列鲜味肽,但其形成机制尚未明确。组织蛋白酶L可通过降解肌原纤维蛋白及肌钙蛋白发挥着重要的滋味形成作用。为了探索其对红鳍东方鲀呈味肽的形成机制,本研究通过查找NCBI数据库得到一条全长为1 336 bp的红鳍东方鲀组织蛋白酶L的序列,从红鳍东方鲀肌肉中提取RNA并转录为cDNA作为模板克隆,选择p ET-28a(+)作为表达载体、E.coli BL21作为重组工程菌进行克隆表达,成功得到大小为36 k D的重组组织蛋白酶L,并验证了其可在大肠杆菌表达系统中成功克隆表达。本研究为进一步研究红鳍东方鲀组织蛋白酶L酶学特性及其对滋味形成提供了理论支持。

巷道掘进及支护技术的应用分析

本文结合工程实际,通过分析探讨煤矿进行巷道掘进和顶板支护的过程中存在的问题,并针对这些问题和不足提出了有效的优化和改进措施,具有重要意义。

掘进工作面安全过断层破碎带技术措施研究

为了降低巷道掘进难度、提高巷道掘进效率、减少冒顶事故的发生,研究了工作面过断层破碎带时顶板破碎、离层和局部冒落现象,提出了合理有效的支护方案及安全管理措施。结果表明:在12#层311盘区311轨道巷过断层带期间,成功解决了311轨道巷开掘断层破碎带时顶板支护难度大、煤柱预留难等问题,保障了矿井的安全生产,取得显著成果。

基于磁蛋白标签的黄曲霉毒素氧化酶的分离及应用

建立了以家鸽磁蛋白(clMagR)分离标签为基础的黄曲霉毒素氧化酶(AFO)分离纯化策略及黄曲霉毒素B1(AFB1)清除体系。将具有AFB1降解活性的AFO与clMagR基因共编码,采用pET 28a(+)载体构建了pET 28a(+)AFO clMagR重组质粒,转入E.coli BL21(DE3)宿主异源表达融合蛋白,并优化表达条件。随后,利用磁性纳米颗粒与磁蛋白的物理吸附,进行AFO的快速分离纯化及其对黄曲霉毒素B1的去毒率测定。结果表明:clMagR标签可增加AFO的可溶蛋白表达量;同时,融合clMagR的AFO具有良好的磁感应性,可通过与磁珠的吸附而被高效分离,纯化后的AFO对于AFB1的去毒率为75.94%,可循环使用13次。本研究为AFO的分离纯化及AFB1的生物去毒化研究提供了新策略,也为其他蛋白的分离纯化及应用提供了良好借鉴。

基于分子模拟的离子液体修饰Porcine Pancreas脂肪酶催化性能和稳定性的相关研究

采用分子模拟手段研究了功能性离子液体[HOOCBMIm]Cl修饰Porcine Pancreas脂肪酶(PPL)结构稳定性与催化性能增强的机理.在335和300 K下比较研究两种脂肪酶的一系列相互作用特点与结构性质,包括静电势(electrostatic potential,ESP)、均方根偏差(Root Mean Square Deviation,RMSD)、能量变化、溶剂化面积等等.分析结果表明:在335K下,修饰后的脂肪酶(Engineered PPL)的RMSD值(0.537?)小于未修饰的脂肪酶(Wild-type PPL)的RMSD值(0.68?),同时Engineered PPL的自由能也低于Wild-type PPL的自由能,说明Engineered PPL的构象更加稳定.修饰剂的引入使得Engineered PPL的疏水性面积和溶剂可及性面积(Solvent Accessible Surface Area,SASA)增大,增强了Engineered PPL的稳定性和水解活力.修饰剂的正电性与修饰位点附近的负电势氨基酸形成静电吸引作用,优化了蛋白表面电荷的相互作用,进一步提高了蛋白稳定性;同时也稳定了蛋白盖子结构的打开状态,有利于底物进入蛋白空腔催化位点,实现催化活性提升.本文从分子水平展示了离子液体修饰脂肪酶并提供了一种解析化学修饰改变酶学性质的方法.

"山东好汉"在美国

我的名字叫张鲁嘉。从名字你一定能猜出我是哪里人了吧?对了,我是山东人!严格地说,我爸爸是山东人。爸爸常跟我说,山东是出好汉的地方。《水浒传》里的一百单八将多出在山东。著名的孔夫子,也是正宗的山东人。所以父母给我起了这个名字。就是希望我能成为一个有所作为、值得称道的山东人。