荧光RT-PCR检测活禽和禽产品中新城疫病毒中强毒株的研究

本研究中，采用TaqMan方法，根据新城疫病毒F基因核苷酸序列，设计合成多对引物，在上游引物和下游引物之间设计多条探针，通过对引物、探针的筛选，反应条件的选择和优化，建立了检测活禽和禽产品中中强毒力新城疫病毒的荧光RT-PCR方法。经对10株倍比稀释的中强毒力新城疫病毒的尿囊液进行检测后，表明所建立的荧光RT-PCR方法的检测极限在10^-5～10^-7”之间，略低于鸡胚病毒分离方法（10^-8～10^-9）；对收集到的所有新城疫病毒株和常见禽类病毒（包括禽流感病毒H5、H9亚型、IBDV、IBV、KIBV、CAAV、鸭瘟病毒、鸭肝炎病毒）进行检测，结果表明建立的方法不能检出其他的常见禽类病毒，特异性良好。进一步用建立的荧光RT-PCR检测人工感染SPF肉鸡的组织脏器、咽喉及泄殖腔拭子及临床样品中的中强毒力的新城疫病毒，并同鸡胚分离结果比较，结果表明荧光RT-PCR的敏感性同鸡胚分离试验基本一致。由于荧光RT-PCR方法快速，从处理样品开始到出结果只需不到4小时，而且检测样品量大，这就充分显示了其快速、敏感、特异的优势。在强调口岸快速通关的今天，该方法的建立无疑为活禽或禽产品的快速检验检疫提供了有效的手段。

新城疫病毒通用型实时RT-PCR检测方法的建立与应用

采用Taq Man方法,经引物和探针的设计、筛选及反应条件优化,研究了检测活禽和禽产品中新城疫病毒的通用型实时RT-PCR(RRT-PCR)方法.结果显示,对12株分别为速发型、中发型、缓发型和疫苗株新城疫病毒的尿囊液倍比稀释液的检测极限在10-5～10-7之间;建立的方法与常见禽类病毒无交叉反应,特异性良好;在检测人工感染肉鸡的脏器组织、咽喉、泄殖腔拭子中病毒的灵敏度同鸡胚分离试验基本一致;弱毒疫苗免疫鸡群在免疫后14 d,应用本方法不能从咽喉、泄殖腔拭子中检测到病毒;临床样品检测表明,该方法不仅可以检出中强毒力新城疫毒株,也可检出缓发型野毒株和疫苗毒株.

间接ELISA检测鸭疫里氏杆菌抗体的研究

本文成功地建立了一种快速、敏感、特异性强的检测鸭疫里氏杆菌１型抗体的方法—酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ）。探讨和确定了ＥＬＩＳＡ的最适条件。通过对３２份阳性血清效价的测定，发现血清１∶１００稀释时的ＯＤ值与血清效价倒数的以２为底的对数之间存在直线相关性，相关系数为０．９７，并由此建立了标准曲线和回归方程。对用不同疫苗免疫鸭的抗体消长规律测定发现，油佐剂疫苗效果最好，甲醛灭活苗两次免疫次之，甲醛灭活苗一次免疫效果最差。从抗体水平角度推断，雏鸭１０日龄左右用苗最好，每只鸭注射０．５ｍｌ是可行的。

荧光RT-PCR检测活禽和禽组织中禽流感病毒的研究

本研究根据A型流感病毒的核酸保守区共有序列 ,开发、设计多条引物和探针序列 ,从中筛选敏感、特异的引物、探针 ,在循环参数、病毒核酸提取方法及逆转录条件优化的基础上 ,建立了快速的通用型“一步法”检测活禽或禽产品中所有A型禽流感病毒的荧光RT -PCR检测技术。该方法敏感性高、特异性强 ,与国际标准方法———世界动物卫生组织 (OIE)确定的鸡胚病毒分离相比 ,敏感性基本一致 ,可直接用来检测咽喉 /泄殖腔拭子和禽肉中的禽流感病毒 ,将检测时间从原来最短所需要的 2 1d缩短为 4h。

荧光RT-PCR在临床检测的应用

用建立的荧光RT -PCR检测中强毒力新城疫病毒的方法检测了 5批临床样品 ,其中有禽肉、鸡咽喉拭子 /泄殖腔拭子、鸽泄殖腔拭子 ,其中检出 3份样品中有中强毒力新城疫病毒 。

荧光RT-PCR检测中强毒力新城疫病毒方法的敏感性和特异性

用建立的荧光RT -PCR检测中强毒力新城疫病毒方法检测 10株不同稀释度的中强毒力新城疫病毒株感染尿囊液 ,并同时与鸡胚病毒分离比较表明 ,荧光RT -PCR检测鸡胚感染尿囊液的最高稀释度为 10 -7,最低为 10 -5,略低于鸡胚病毒分离。对 2 3株不同毒力的新城疫病毒用荧光RT-PCR进行了测定看出 ,本课题建立的荧光RT -PCR可以区分中强毒力新城疫病毒和疫苗弱毒。用建立的荧光RT -PCR检测中强毒力新城疫病毒株方法检测常见的禽类病毒 。

中强毒力新城疫病毒(NDV)荧光RT-PCR检测方法建立及体系优化

根据新城疫病毒F基因序列 ,选择能够反应裂解位点特性且缺乏二级结构的保守区设计多对引物和探针 ,从中筛选出最佳引物、探针配对 ,对引物、探针的浓度、Taq酶用量、逆转录酶、循环数、逆转录反应体积、样品RNA提取方法等进行了优化 ,建立了快速检测中强毒力新城疫病毒的方法-荧光RT -PCR。

牛阴茎纤维乳头状瘤的检疫技术及防止传入对策

为防止在进口种用公牛的同时传入牛阴茎纤维乳头状瘤 ,详细介绍了牛阴茎纤维乳头状瘤的危害及如何从临床发现该病 ,如何从病理学和病原学确诊该病。介绍了北京局近年来检出该病情况。从把关角度 ,提出了防止该病传入的对策。

荧光RT-PCR检测NDV人工感染肉鸡组织脏器的应用研究

用 6株新城疫病毒分离株人工感染 2 8日龄肉鸡 ,感染后 3天采集咽喉拭子和泄殖腔拭子 ,对死亡鸡进行病理剖检 ,取心、肝、脾、肺、肾、小肠、腿肌、胸肌等 ,制备组织脏器悬液 ,作倍比稀释 ,用建立的荧光RT -PCR方法检测并同鸡胚分离比较。试验表明 ,荧光RT -PCR检测组织脏器和拭子的敏感性同鸡胚分离的敏感性基本一致 ,荧光RT -PCR检测脏器的最低检测量为 5X10 -5,肌肉的最低检测量为5X10 -3,拭子的最低检测量为 10 -3。用不同的样品处理方法处理样品做荧光RT -PCR表明 ,裂解液处理样品方法优越 。

荧光RT-PCR快速检测技术检测鸭场环境中禽流感病毒

本研究应用荧光RT-PCR方法和鸡胚病毒分离方法,对两个禽流感发病后康复鸭场和一个健康鸭场采集的环境样品、部分健康和死鸭的拭子脏器进行检测,结果显示荧光RT-PCR方法同病毒分离方法的符合情况较好,阴性符合率为100%,病毒分离检出阳性样品经荧光RT-PCR检测全部为阳性。表明该方法在检测禽流感病毒的环境释放方面有重要应用价值,能够检出环境样品中的禽流感病毒。但其中的8份样品荧光RT-PCR显示为弱阳性或可疑,鸡胚分离的结果为阴性。推测这些样品中的病毒虽被灭活,但核酸并没有完全降解。

牛肠道病毒2型的分离与鉴定

本研究从北京某牛场发生严重腹泻的泌乳奶牛采集直肠拭子,接种MDBK细胞,分离获得1株病毒,命名为BJ001。理化特性鉴定结果表明,该病毒大小约30nm,为无囊膜的RNA病毒;用随机PCR方法对氯化铯梯度离心后的各区带扩增,扩增产物凝胶电泳后,回收"呈彗尾样拖带现象"最明显的区带2的500～1 500bp的片段进行序列测定与分析,结果显示,扩增片段与GenBank中已知的牛肠道病毒2型相似性较高;用BEV2型特异性引物对病毒进行RT-PCR扩增,并将扩增产物进行序列测定与分析,结果表明,其与BEV2相似性最高可达93%。故该病毒被确定为牛肠道病毒2型。将该病毒接种2头成年健康奶牛,均未出现肉眼可见的临床症状,但病毒可在接种奶牛体内持续存在,并产生较高滴度抗体。

动物病毒核酸检测质控品和标准物质研究进展

近年来，以核酸扩增为基础的分子检测技术，以其快速、敏感、特异、定量准确，而且对实验室生物安全环境要求低等特点，在动物疫病病原的检测中得到了广泛的应用，逐渐成为动物疫病检测的主流技术。

非洲马瘟病毒VP7基因拼接、表达及重组ELISA方法的建立与初步应用

采用人工拼接的方式拼接了非洲马瘟病毒(AHSV)含有绝大多数线性抗原表位的VP7编码基因片段,克隆于pET-30a构建重组质粒pET-30a-VP7,将pET-30a-VP7转化BL21(DE3),经1.0 mmol/L IPTG诱导,外源基因以包涵体的形式获得高效表达。通过Dot-ELISA以及ELISA试验证明表达产物具有良好的反应原性。以纯化后表达产物作为诊断抗原包被酶标板建立了检测AHSV抗体的间接ELISA方法。结果表明,抗原的最佳包被浓度为0.25μg/mL,血清的最佳稀释度为1∶40,待检血清阳性临界值初步定为0.25。用此方法和商品化ELISA试剂盒检测了184份血清样品,结果完全符合。

牛肠道病毒TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立

为建立快速、准确地检测牛肠道病毒(BEV)及对北京周边地区牛群中BEV感染情况进行检测,本研究通过设计合成扩增BEV 5'UTR序列的引物及探针建立了检测BEV的通用型TaqMan荧光定量RT-PCR快速检测方法并对反应条件进行了优化。该方法对BEV的最小检测量为0.1 TCID50/0.1 mL,敏感性比病毒分离法高10倍。而且该方法对其他牛相关病毒均无交叉反应。用3批试剂对3个稀释度的BEV培养物进行批内和批间重复性试验,其变异系数均小于1.1%,表明该方法具有良好的重复性。采用该方法对北京周边地区牛群采集的852份临床样品进行检测,并与病毒分离方法比较,两种方法检测结果完全一致。因此,本研究所建立的BEVTaqMan RT-PCR检测方法具有快速、准确、特异性强、敏感性高、重复性好的优点,为国内BEV的检测提供了有力的技术支持。本研究首次通过病毒核酸检测证明了我国部分地区的牛群中存在BEV感染。

戊型肝炎病毒荧光定量RT-PCR快速检测技术的建立和初步应用

利用DNAMAN软件对GenBank登录的戊型肝炎病毒四个主要基因型代表株的序列进行分析,选择其高度保守的ORF2区域设计合成引物和探针,并用包含有扩增区域的核苷酸片段进行体外转录制备标准品cRNA。在对荧光定量RT-PCR的反应条件优化的基础上,建立了适用于戊型肝炎病毒主要基因型检测的荧光定量RT-PCR检测技术。该检测技术可以有效检测I型和IV型戊型肝炎阳性病料,而对猪的其它几种疫病阳性病料则为阴性结果,证实本技术的特异性强、可靠性好。对阳性标准品的检测结果表明,所建立的TaqMan荧光定量RT-PCR灵敏度可达2.0×10^1拷贝/反应,相比于巢式RT-PCR方法,其灵敏度高10-100倍以上。在对54份临床样品的检测中,进一步证实了该方法快速、灵敏且重复性好,可满足戊型肝炎病毒早期快速诊断的需要。

IPMA检测猪生殖和呼吸综合征病毒抗体的研究

本研究在国内首次成功地建立了免疫过氧化物酶单层细胞试验（ＩＰＭＡ）检测猪生殖和呼吸综合征病毒（ＰＲＲＳＶ）抗体。应用ＩＰＭＡ检测了北京地区３个猪场９４份血清发现，英国株抗体阳性检出率为９．６％（９／９４），美国株Ｍ１的抗体阳性检出率为５１％（４８／９４）。同间接荧光抗体试验ＩＦＡ比较阳性检出率基本一致。利用ＩＦ和ＩＰＭＡ两种方法检测１８２份加拿大进口猪血清均有３头阳性，且编号相同，本试验证实了ＩＰＭＡ是一种检测ＰＲＲＳ抗体的有效方法。

亚洲Ⅰ型口蹄疫病毒核酸检测标准物质的制备研究

针对目前口蹄疫病毒核酸扩增检测缺乏标准物质的现状,以口蹄疫病毒亚洲Ⅰ型核酸为模板,分别设计引物扩增具有检测意义的5′端1nt～2208nt的片段(含完整的5′NCR)和3012nt～5155nt片段(含完整1D～2B区域),并克隆于pMD20-T。测序后采用体外转录方法制备2种RNA纯品,进行初步定量稀释后等量混合分装。采用荧光定量RT-PCR方法进行均匀性和稳定性检验后,委托外部实验室对RNA片段进行拷贝数定值。结果显示,制备的标准品均匀性和稳定性良好。

猪流感病毒核酸检测装甲RNA质控样品的研制

为研制一种可以应用于猪流感病毒(SIV)核酸检测的质控品,本研究选取MS2噬菌体装甲RNA(Armored RNA)作为RNA病毒核酸检测质控样品,将MS2噬菌体成熟酶蛋白基因、衣壳蛋白基因、包装位点及SIV M基因克隆于表达载体pET-32a中,经原核表达后,利用Cellufine sulfate层析柱纯化,RT-PCR和实时荧光RT-PCR鉴定表明制备的装甲RNA(AR-SIVM)病毒样颗粒中包装有SIV M基因。稳定性研究显示,AR-SIVM可以耐受RNase的降解,并且在-20℃和4℃至少可以保存3个月。试验结果表明,AR-SIVM作为SIV核酸检测质控样品,能够实现对检测全过程(核酸提取、反转录和PCR)的质量控制。