乙型肝炎病毒DNA聚合酶逆转录酶蛋白反式调节基因1的克隆化研究

目的 应用抑制性消减杂交 (SSH)技术及生物信息学 (bioinformatics)技术筛选并克隆乙型肝炎病毒 (HBV)DNA聚合酶(DNAPolymerase)逆转录酶 (RT)区蛋白的反式调节新型靶基因 ,进一步阐明HBV感染相关疾病的发病机制。方法 以HBVDNA聚合酶RT基因的表达质粒pcDNA3 1( -) RT转染HepG2细胞 ,以空载体pcDNA3 1( -)为平行对照 ,提取mRNA并进行SSH分析。并应用分子生物学技术 ,结合生物信息学技术 ,克隆RT反式调节作用的新的靶基因。结果 对于所获基因片段序列分析表明 ,其中之一为新型基因片段。从HepG2细胞提取总RNA ,以逆转录多聚酶链反应 (RT PCR)技术扩增获得该新基因的全长序列 ,并测序证实 ,因其可以被HBVDNA聚合酶逆转录酶RT反式激活 ,故命名为DNA多聚酶反式激活蛋白 1(DNAPTP1) ,已在GenBank中注册 ,注册号 :AY45 0 3 89。DNAPTP1基因的编码序列全长为 43 5个核苷酸 (nt) ,编码产物由 14 4个氨基酸残基 (aa)组成。结论 HBVDNA聚合酶逆转录酶RT在HBV进入宿主细胞的过程中起着重要的作用 ,最近的研究表明RT蛋白还具有反式激活的作用 ,上调宿主细胞某些基因的表达 ,从而改变宿主正常的免疫应答水平 ,引起病变。逆转录酶RT反式激活新靶基因的发现 ,为进一步研究RT蛋白的分子生物学机制和探索新型治疗?

丙型肝炎病毒非结构蛋白2反式调节基因NS2TP的克隆化

目的:克隆化HCV非结构蛋白2(NS2)蛋白反式调节靶基因(NS2TP). 方法:依据我们构建的HCV NS2反式调节基因差异表达的cDNA消减文库筛选结果,利用分子生物学与生物信息学技术获得新基因NS2TP的编码序列,设计特异性引物,并对其进行克隆化研究. 结果:NS2TP基因编码区为456核苷酸(nt),编码产物为151氨基酸残基(aa),经核苷酸序列数据库(GenBank)和蛋白质一级结构序列数据库(SwissProt)同源序列的搜寻,与已知基因序列和蛋白序列之间没有显著同源性,属于未知功能新基因. 结论:发现了HCV

应用抑制性消减杂交技术筛选丙型肝炎病毒非结构蛋白2反式调节基因

目的:构建丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白2(NS2)反式调节基因cDNA消减文库,研究HCVNS2蛋白的反式调节基因。方法:应用抑制性消减杂交(SSH)技术筛选转染pcDNA3.1(-)NS2和空载体pcDNA3.1(-)的HepG2细胞差异性表达基因,并进行生物信息学分析。结果:获得12个差异表达的已知蛋白基因和3个未知功能基因序列,包括:磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(glypican3,GPC3)、酸性核糖体磷蛋白PO、核糖体蛋白L13a、整合素β1、天冬酰胺合成酶、信号肽酶、α2HS糖蛋白、小核糖体蛋白多肽G、蛋白酶样亚单位、黄体酮受体、SDR家族脱氢酶8、Ras家族RAB4A、具有BTB/POZ结构的新蛋白、具有coiled coil helix结构的新蛋白、未知功能基因。结论:成功构建HCVNS2反式调节的相关基因cDNA消减文库,为今后进一步分析、研究病毒蛋白的致病机制提供了线索。

应用表达谱芯片技术研究NS5ATP13的反式调节基因

目的:应用基因表达谱芯片研究HCV非结构蛋白NS5A反式激活基因NS5ATP13的反式调节基因. 方法:构建NS5ATP13基因的真核表达载体pcDNA3.1(-)- NS5ATP13,应用基因表达谱芯片技术对pcDNA3.1(-)- NS5ATP13转染的人肝母细胞瘤细胞系HepG2细胞和转染空载体的相同细胞的差异表达mRNA进行检测和分析. 结果:HepG2细胞经转染NS5ATP13后,有86条差异基因表达,其中46条基因表达增强,40条基因表达降低.这些差异表达的基因与细胞的增生、分化及细胞的信号转导、代谢、凋亡密切相关. 结论:应用基因表达谱芯片成功筛选了NS5ATP13的反式调节基因,为进一步阐明NS5ATP13的反式激活作用及免疫调节机制提供了新的依据.

酵母双杂交技术筛选白细胞cDNA文库中新基因NS2TP蛋白结合蛋白基因

目的:筛选HCV非结构蛋白2(NS2)反式调节蛋白(NS2TP)的结合蛋白,探讨HCV的致病机制及新蛋白NS2TP的生物学功能. 方法:应用酵母双杂交系统3,将PCR法扩增的NS2TP 基因连接入酵母表达载体pGBKT7中构建诱饵质粒, 转化单倍体酵母细胞AH109并在其内表达,然后与转化了人白细胞文库质粒pACT2的单倍体酵母细胞Y187进行配合,在营养缺陷型培养基和X-α-半乳糖(C-α-gal)上进行双重筛选,提取阳性酵母茵落的质粒转化大肠杆茵氨苄青霉素-LB平板上选择并测序,结果在GenBank中进行生物信息学分析. 结果:筛选出与NS2TP结合的蛋白基因25个,其中包括细胞色素p450 2E1、核心蛋白聚糖、p68、β2微球蛋白、羧肽酶N2等已知功能基因及3个未知功能序列. 结论:为阐明新蛋白NS2TP的分子生物学功能及HCV 的致病机制提供了新的思路.

乙型肝炎病毒DNA聚合酶逆转录酶反式调节蛋白1基因的克隆化研究

目的 应用抑制性消减杂交 (SSH)技术及生物信息学 (bioinformatics)技术筛选并克隆乙型肝炎病毒 (HBV)DNA聚合酶(DNAPolymerase)逆转录酶 (RT)反式调节新型靶基因 ,进一步阐明HBV感染相关疾病的发病机制。方法 以HBVDNA聚合酶逆转录酶表达质粒pcDNA3 .1( ) RT转染HepG2细胞 ,以空载体pcDNA3 .1( )为平行对照 ,提取mRNA并进行抑制性消减杂交分析。并应用分子生物学技术 ,结合生物信息学技术 ,克隆RT反式调节作用的新的靶基因。结果 对于所获基因片段序列分析表明 ,其中之一为新型基因片段。从HepG2细胞提取总RNA ,以逆转录多聚酶链反应 (RT PCR)技术扩增获得该新基因的全长序列 ,并测序证实 ,因其可以被HBVDNA聚合酶逆转录酶反式调节 ,故命名为DNA多聚酶反式调节蛋白 1(DNAPTP1) ,已在GenBank中注册 ,注册号AY45 0 3 89。DNAPTP1基因的编码序列全长为 43 5个核苷酸 (nt) ,编码产物由 14 4个氨基酸残基 (aa)组成。结论 逆转录酶反式调节新靶基因DNAPTPl的发现 ,为进一步研究RT蛋白的分子生物学机制和探索新型治疗技术奠定基础。

甘草酸类药物治疗自身免疫性肝炎疗效分析

探讨甘草酸类药物治疗自身免疫性肝炎(AIH)的疗效。应用甘草酸单胺组、甘草酸二胺组和复方甘草甜素组治疗79例AIH患者,并与糖皮质激素治疗AIH 21例患者作比较,观察其肝功能的变化,评价其疗效。3组甘草酸类药物治疗AIH可明显降低ALT,AST,TB il,DB il水平,分别获得78.2%、81.6%和82.7%的完全应答率,与激素治疗组的完全应答率(83.3%)比较,差异无显著性(P>0.05);两类药物治疗Ⅰ、Ⅲ型AIH的疗效高于Ⅱ型AIH。甘草酸类药物治疗AIH可获得与激素相同的近期疗效,但其长期疗效尚待进一步评价。

自身免疫性肝炎临床、免疫学及病理学特征分析142例

目的:了解自身免疫性肝炎(AIH)患者的临床、免疫学和病理学特点.方法:回顾性分析142例AIH患者的一般资料、临床特点、生化检查、免疫学检查和自身抗体的结果.结果:142例AIH患者男女比例1∶3.73,发病年龄为52.57±14.85岁,首次发病诊断分别为慢性肝炎(42.3%)、急性肝炎(34.5%)、重型肝炎(9.9%)和肝硬化(13.4%);临床表现主要为乏力(97.2%)、纳差(84.5%)、黄疸(84.5%)、发热(19.0%)、恶心(14.1%)和腹胀(12.7%)等.生化检查显示,ALT、AST、TBIL水平升高.AIH亚型中Ⅰ型多见(92.2%),Ⅱ型少见(6.3%),Ⅲ型罕见,仅1例.AIH重叠原发性胆汁性肝硬化(PBC)占14.1%,合并其他自身免疫性疾病占17.6%.免疫学检测显示,γ球蛋白和IgG升高明显.自身抗体检测出不同类型21种,以抗核抗体(82.4%),抗平滑肌抗体(19.7%),抗线粒体抗体(19%),抗SSA抗体(9.2%)多见.肝活检19例,均可见不同形式的肝细胞变性,坏死和浆细胞浸润,17例患者存在不同程度的纤维增生,1例有胆管轻度破坏.结论:AIH女性多见,发病和临床表现无特异性,生化检查以肝细胞损伤为主,Ⅰ型AIH最多见,检出自身抗体种类较多,但特异性和敏感性较高的自身抗体尚待进一步研究.肝组织学改变主要为不同程度的肝细胞变性,坏死,浆细胞浸润和纤维增生.胆管破坏少见.

阿德福韦在乙型肝炎中的应用现状

0引言 乙型肝炎病毒(HBV)不仅可形成急、慢性病毒性肝炎,而且与肝纤维化、肝细胞癌的发生、发展密切相关.目前对慢性乙型肝炎有两种基本的治疗方法,一种是免疫激活治疗如干扰素,另一种是抑制病毒复制如核苷类似物.阿德福韦作为一种新的抗HBV感染的核苷酸类似物已经于2002-09经FDA批准在美国上市,目前在我国正在进行3期临床实验.本文就阿德福韦的研究现状及临床观察作一综述.

应用抑制性消减杂交技术研究甘草甜素免疫调节靶基因

目的应用抑制性消减杂交(SSH)技术构建甘草甜素刺激的人T淋巴细胞Jurkat差异表达基因的cDNA消减文库,筛选并克隆甘草甜素免疫调节靶基因,阐明甘草甜素免疫调节的分子生物学机制。方法以甘草甜素刺激Jurkat细胞,同时以生理盐水刺激的相同细胞作为对照;24h后提取mRNA并逆转录为cDNA,进行抑制性消减杂交分析并构建cDNA消减文库,随机挑选文库克隆,PCR扩增后进行测序及同源性分析。结果文库扩增后得到28个阳性克隆,进行菌落PCR分析,均得到200～1000bp插入片段。挑取含有插入片段的22个克隆进行测序,并通过生物信息学分析获得11种已知蛋白基因编码序列。主要包括IL-12、IL-18、胸腺素等免疫调节基因。结论应用SSH技术成功构建了甘草甜素处理的淋巴细胞差异表达基因的cDNA消减文库。为进一步阐明甘草甜素的免疫调节机制及深入了解甘草甜素用于防治病毒性肝炎的药理作用机制提供了依据。

乙型肝炎病毒DNA聚合酶反式调节人类新基因HBVDNAPTP1的克隆及原核表达与组织表达分析

目的克隆应用抑制性消减杂交(SSH)技术及生物信息学技术筛选得到的乙型肝炎病毒(HBV)DNA聚合酶反式调节新型靶基因HBVDNAPTP1,构建HBVDNAPTP1基因的原核表达载体,诱导其在大肠埃希菌中表达,并进一步分析HBVDNAPTP1在组织中的分布表达水平。方法应用RT-PCR技术扩增获得HBVDNAPTP1基因片段,测序正确后插入至原核表达载体pET-32a(+)中,转化BL21(DE3)宿主菌,IPTG诱导以获得HBVDNAPTP1融合蛋白的表达,利用Westernblot证实表达蛋白的特异性。应用UniGene数据库对HBVDNAPTP1基因的染色体中定位及组织分布表达水平进行分析。结果RT-PCR扩增获得HBVD-NAPTP1基因片段,插入pET-32a(+)表达载体,转化BL21(DE3)受体菌,经IPTG诱导获得了HBVDNAPTP1重组蛋白的表达,Westernblot证实了表达的重组蛋白的特异性。HBVDNAPTP1在多数组织中低表达,仅在脑垂体腺、扁桃体、舌、胸腺、气管与脐带中无表达。结论成功构建了HBVDNAPTP1基因的原核表达载体,利用大肠埃希菌原核表达系统获得了重组蛋白的表达,并初步了解了HBVDNAPTP1基因的染色体定位与组织表达水平。

应用噬菌体展示技术筛选HBsAg启动子I的DNA结合蛋白

目的:通过筛选HBsAg基因启动子Ⅰ(SP Ⅰ,surface promoter Ⅰ)结合蛋白,为HBV复制机制的研究探索新的途径. 方法:应用噬菌体展示技术,以HBsAg基因启动子Ⅰ的聚合酶链反应(PCR)产物DNA作为固相筛选分子,对噬菌体人肝细胞cDNA文库进行4轮“黏附-洗脱-扩增”筛选过程,经噬斑的PCR扩增后,构建克隆载体,最后对所筛选克隆进行DNA序列分析和同源性搜索. 结果:噬菌体经富集后,从随机筛选的14个克隆中得到8 个阳性克隆,成功构建了克隆载体.序列测定后经过同源性搜索,确定了和HBV表面抗原基因启动子Ⅰ特异结合的肝细胞蛋白,共编码7种蛋白.其中3个克隆编码未知功能蛋白;其余的克隆分别编码4-氨基丁酸氨基转移酶、触珠蛋白、复制蛋白等蛋白. 结论:用噬菌体人肝cDNA文库筛选得到HBsAg基因启动子Ⅰ的结合蛋白,分析了该蛋白的编码基因.

乙型肝炎核心启动子的研究进展

乙型肝炎病毒(HBV)核心启动子(CP)与病毒复制、转录及疾病的关系密切,近年来国内外对核心启动子的结构、功能进行了广泛的研究,但目前研究的热点集中在核心启动子变异后的生物学活性改变以及与治疗的关系等方面,本文就其研究进展作一综述.

乙型肝炎病毒前-前-S蛋白在大肠杆菌中的表达和纯化

目的:在大肠杆菌中表达乙型肝炎病毒(HBV)前-前-S蛋白,并进行纯化和鉴定.方法:通过聚合酶链式反应(PCK)获得HBV前-前-S基因,将前-前-S克隆至PET32a+,构建原核表达重组质粒,在大肠杆菌中诱导表达,表达产物进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE),考马斯亮蓝染色.采用凝胶电泳回收纯化.经Westernblot.结果:成功扩增获得HBV的前-前-S编码基因片断,并构建大肠杆菌表达载体.表达载体转化的大肠杆菌经过IPTG的诱导,裂解,SDS-PAGE,结果显示得到了目的蛋白Mr28000.以抗-His的单克隆抗体进行的westernblot杂交实验,结果表明表达、纯化的目的蛋白具有特异性免疫反应识别.结论:成功表达HBV的前-前-S蛋白,对于研究HBV的前-前-S蛋白的免疫原性和生物学特性奠定了坚实的基础.

丙型肝炎病毒F蛋白反式激活基因2的表达纯化及多克隆抗体制备

目的构建丙型肝炎病毒(HCV)F蛋白反式激活基因2(FTP2)的原核表达载体并诱导其表达,制备多克隆抗体并探讨其在临床病理组织中表达的意义。方法通过PCR获得HCVFTP2基因,将其克隆至原核表达载体pET32a(+)上,构建重组表达载体,在大肠埃希菌BL21中诱导表达。表达产物经SDS-PAGE及Western blotting验证后进行大量表达并纯化。将纯化的重组蛋白免疫家兔获得多克隆抗体,并将此抗体作为诊断试剂观察其在正常肝组织和临床病理组织中的表达情况。结果以pET32a(+)-FTP2表达载体转化BL21菌后,经IPTG诱导,成功获得大量重组蛋白,分子量约为25kD。将此重组蛋白免疫新西兰兔获得多克隆抗体,经抗体间接ELISA检测证明,多克隆抗体效价>1:128000,免疫组化显示多克隆抗体能够与丙型肝炎、肝硬化、肝细胞癌等临床病理组织产生FTP2抗原反应。结论成功表达了HCV的FTP2蛋白并制备了其多克隆抗体,证实FTP2与丙型肝炎、肝硬化的发病机制密切相关。

低剂量三氧化二砷对HepG2细胞p53基因转录水平的下调作用

目的:探讨低剂量三氧化二砷(As2O3)对p53启动子转录活性的调节作用。方法:确定p53启动子区域,聚合酶链反应(PCR)扩增p53p,克隆至真核报告载体pCAT3-Basic中,构建pCAT3-p53p报告载体;以该质粒转染肝癌细胞系HepG2细胞系,用酶联免疫吸附法(ELISA)检测氯霉素乙酰转移酶(CAT)的表达活性;并以不同浓度三氧化二坤刺激HepG2细胞系,用ELISA法检测CAT的表达活性。结果:成功克隆出614 bp的新的p53 启动子,pCAT3-p53p和不同浓度的三氧化二砷(0．25 μmoL／L)瞬时转染的HepG2细胞的CAT表达活性是 pCAT3-Basic空载体的11．2倍,表明pCAT3-p53p具有强的启动子活性。选用0．25、0．5、2．5、5．0μmol／L浓度的三氧化二砷刺激pCAT3-p53p转染的HepG2细胞,其CAT吸光度值分别为:0．076、0．186、0．149、0．119,CAT活性随着三氧化二砷浓度的倍增呈衰减趋势。结论:p53启动子有反式激活下游基因表达的活性,低剂量三氧化二砷对p53基因转录水平具有下调作用。

艾滋病患者眼科临床特点分析

目的阐明艾滋病患者HIV相关眼病的临床特征。方法回顾性研究了92例艾滋病患者的临床资料及眼科会诊记录。结果在HIV相关眼病患者中,HIV微血管病变者32例(34.8%),其次为视网膜炎25例(27.5%),免疫重建综合症后出现的全葡萄膜炎2例(2.2%)。在有或无HIV相关眼病患者中,伴有眼科症状的比例分别为28例(56.0%)和20例(47.6%);平均CD4水平分别为0.087×109/L和0.224×109/L(P<0.05)。结论 HIV微血管病变是主要的HIV相关眼病,其次为视网膜炎,且不同的眼科病变可以并存;CD4+T淋巴细胞低于0.05×109/L与HIV相关眼病的发生有关;必须对所有CD4+T淋巴细胞低于0.05×109/L的艾滋病患者完善常规眼科学筛查,以期早期发现HIV相关眼病。

149例重症手足口病患儿临床分析

目的探讨重症手足口病(HFMD)的临床特征、分型和处置方案,提高重症HFMD患者的治愈率和生存率。方法对149例重症HFMD患儿的流行病学、临床表现、病情动态变化、实验室检查及物理检查、治疗及转归进行回顾性分析。结果 149例重症HFMD患儿,男98例(65.8%),女51例(34.2%);年龄5个月～13岁,﹤3岁者92例(61.7%),平均年龄3.3岁。依据临床表现及并发症分为两组:Ⅰ组,并发症以神经系统症状为主要表现者,140例(94%),均存活;Ⅱ组,并发神经、循环、呼吸等系统多器官损害者,9例(6%),3例死亡。存活患儿目前无后遗症出现。结论 HFMD重症病例分为重型和危重型两型,危重型可引起死亡。在临床工作中密切监测,及时发现危重型倾向的病例,正确及时治疗,能提高重症HFMD患儿的生存率,减少并发症和后遗症,改善生存质量。