通过改变土壤pH及菌群结构缓解杭白菊连作障碍

目的:寻找缓解杭白菊连作障碍的方法并阐明其缓解障碍的微生态机制。方法:实验分为6组,即连作组、轮作组、蚕沙发酵肥组、蚕沙未发酵肥组、市售菌肥组及石灰组,于收获期统计杭白菊的存活率、产量、株高以及分枝数,采用Miseq测序技术对6个处理组的杭白菊根际土壤细菌群落多样性及结构进行分析。结果:连作杭白菊的存活率、产量、株高以及分枝数均为最低;土壤酸化严重,p H仅4.79;根际土壤酶活性及细菌多样性水平也最低。而施用蚕沙发酵肥、蚕沙未发酵肥、市售三矩灌金液菌肥、石灰均能有效改善白菊连作障碍,其存活率、产量、株高以及分枝数显著提高。比较土壤理化性质后发现,无论是施用菌肥还是石灰,土壤p H、酶活性以及细菌多样性水平均显著上升,有机质含量则没有显著性差异。比对前20个优势菌属发现,3个菌肥组中的优势菌属种类差异不大,主要表现在含量上的差异。菌肥的施用促进了土壤中一些优势细菌类群数量的增长,如Gp1、Rhizomicrobium、Pseudolabrys、Gp2、Burkholderia、Bradyrhizobium、Devosia、Bacillus、Sphingomonas、Chitinophaga等,其中Devosia、Bradyrhizobium、Bacillus、Burkholderia、Sphingomonas与Chitinophaga均是益生菌。石灰组中的细菌组成与菌肥组差异较大,其中一些益生菌如Arthrobacter、Paenibacillus、Nitrosospira、Ohtaekwangia、Tepidamorphus、Dongia仅在石灰组中特有。结论:无论施肥还是改变土壤p H均可提高杭白菊产量,增加存活率,其微生态机制主要是通过提高土壤p H、酶活性以及细菌多样性水平,增加有益菌的种类和数量,从而达到缓解杭白菊连作障碍的作用。

浙贝鳞茎及根际土中元素含量在不同产区和物候期的差异及相关性分析

[目的]研究浙贝及土壤中无机元素的含量,探讨根际土与浙贝鳞茎中元素的相关性以及元素对浙贝道地性形成的作用,为浙贝的栽培提供科学理论指导。[方法]采用电感耦合等离子体发射光谱仪(ICP-OES)和微波消解仪测定不同产区、种源和物候期的浙贝及土壤中15种无机元素的含量,并进行聚类、吸收系数和相关性分析。[结果]聚类分析结果表明,浙贝土壤和鳞茎中的元素含量特征主要以产区来划分,说明产区外环境对浙贝母元素吸收的影响大于种源和生长物候期等因子。浙贝鳞茎中重金属元素Pb、Cd的变异系数都较大,微量元素的变异程度比常量元素大。浙贝对P、S、Mg的吸收系数均大于100%为富集元素,而B、Fe、Al等元素的吸收系数均在1%以下为高贫富集元素,说明富含P、S、Mg等元素的土壤可能对浙贝生长有利。相关性分析表明,鳞茎中的B元素与土壤中的B呈现极显著正相关,除此之外,鳞茎中的B与还与土壤中的Ca、Fe、K、Mg、Mn、Zn、Cr等呈极显著正相关;而鳞茎中的Cu、Cd等重金属与土壤中的元素大部分呈显著负相关,说明这些元素之间会相互作用,或促进或拮抗,从而影响植物的生长。[结论]产区环境对浙贝母元素特征的影响效果大于种源及物候期的影响,浙贝鳞茎中元素与土壤中的元素关系复杂,其中鳞茎中的B、Cu、Cd与土壤元素关系密切而复杂,在研究和栽培中值得进一步关注。

蚕沙发酵有机肥对连作杭白菊根际细菌群落的影响

[目的]在杭白菊连作3年的土壤上采用小区实验方法施用蚕沙发酵有机肥,探讨施用蚕沙发酵有机肥对连作杭白菊根际土壤细菌群落的影响。[方法]田间实验设置3个处理组,依次为轮作组(杭白菊与玉米进行轮作),连作组(杭白菊连作3年),施肥组(在杭白菊连作田,第3年种植初期每株施用蚕沙发酵有机肥15 g)。在收获期进行采样,用HaeⅢ、HinfⅠ分别进行酶切后,采用末端限制性片段长度多样性(T-RFLP)检测。[结果]连作组、轮作组和施肥组的HaeⅢ酶切后Shannon指数分别为:3.08、3.24、3.24,HinfⅠ酶切后Shannon指数分别为3.31、3.60、3.57,可见连作组的细菌多样性明显低于轮作组和施肥组,说明连作使杭白菊根际细菌生物多样性下降,而轮作和施肥则可显著提高根际细菌多样性水平。对优势菌属进行比对分析发现,不同处理组间有较大的差异。连作组的9种优势菌属中梭酸属(Clostridium)、植原体属(Phytoplasma)、黄单胞菌属(Xanthomonas)为致病菌属;施肥组的8种优势菌属中梭酸属和黄单胞菌属为致病菌属,另6种为有益菌;轮作组的8种优势属中仅有梭酸属为致病属,其余7种均为有益菌。由此推测,施肥和轮作处理均会改变根际细菌群落结构,主要体现在减少致病菌的伤害。此外,在施肥组中还发现有被誉为生防菌的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。[结论]施用蚕沙发酵有机肥,能有效提高连作杭白菊的根际土壤细菌多样性水平,降低病原菌优势,促进功能菌和有益菌的生长,通过改善微生态环境缓解连作障碍。

浙贝母中内生菌的多样性及组成分析

[目的]研究浙贝母器官内生菌群,以期探明浙贝母道地性的形成机制,为开发其潜在的内生菌资源提供理论依据。[方法]本实验用PCR-变性凝胶梯度电泳(DGGE)对浙贝母的根、鳞茎、地上茎以及叶中的内生菌多样性和组成进行了检测和分析。[结果]DGGE结果表明,浙贝母不同器官中的内生菌多样性和结构均有差异。根部条带明显比其它器官多,内生细菌多样性指数最高(2.69),而且出现不少特异性条带;茎中的细菌多样性为2.44;叶中最低,仅2.21。测序结果表明,浙贝母中的内生细菌主要为蓝细菌、根瘤菌、睾丸酮假单胞菌、伯克氏菌属和燕麦噬酸菌,后两种菌均为β-变形菌,该菌的存在可能会对浙贝母的生长产生不利影响,而根瘤菌和丛毛单胞菌则对其生长有利。根部特异性细菌包括蓝细菌(B4)、伯克氏菌属(B23)、根瘤菌(B5、B24)以及3种不可培养细菌(B6-B8)。与细菌相比,内生真菌DGGE图谱在不同器官之间的差异更小,大部分为共有条带,只是亮度有差异。当然也有特异条带,如曲霉属(F10)仅在鳞茎中出现。镰孢菌属(F11)以及2种不可培养的真菌(F5、F6)为根部特有。与细菌不同,地上茎中的真菌Shannon指数最高(2.82),其次是鳞茎和根,叶最低2.53。利用DGGE检测到浙贝母的内生真菌主要为侧齿霉、镰孢霉和曲霉,而利用传统方法还分离到交链孢霉、青霉、拟茎点霉、葡萄孢、卵形孢霉、枝链孢霉、毛壳菌、丝核菌以及束丝菌等属,说明对浙贝母而言,传统方法更适合。[结论]浙贝母不同器官中内生细菌和真菌的多样性及组成均存在差异,但地下鳞茎和地上茎差异较小;真菌的器官差异不如细菌明显。浙贝母内生菌的分布跟其它植物明显不同,其菌群组成主要取决于浙贝母宿主植物本身。不同的内生菌占据不同生态位,执行不同功能,有的对促进浙贝母的生长,而有的则影响生长,其中侧齿霉属值得进一步研究。

PCR-DGGE蝴性结肠炎大鼠胃肠道中细菌多样性研究

目的探讨溃疡性结肠炎对大鼠胃肠道微生物多样性影响，为治疗溃疡性结肠炎提供可靠依据。方法采用2，4-二硝基氯苯乙酸复合法对健康SD大鼠进行溃疡性结肠炎造模；运用CTAB—SDS法提取肠道微生物总DNA，通过PCR．DGGE分析溃疡性结肠炎大鼠之间胃肠道微生物多样性差异。结果溃疡组、用药组和正常组大鼠的消化道中，不同部位细菌Shannon~数变化较大（1．64-3．05），结肠中Shannon指数最高，其次是胃，小肠最低。在结肠，不同组的细菌多样性Shannon指数变化幅度不大，以用药组最高（3．05），其次溃疡组（2．98），正常组2．95，说明大鼠结肠在健康状态下细菌多样性最低，结肠炎后会发生一定的变化。此外，发现病变后的大鼠胃中拟杆菌属、梭菌属、普氏菌属、紫单胞菌属等厌氧细菌增加，病变后的结肠中乳杆菌属细菌明显减少，紫单胞菌属和梭菌属细菌明显增加；病变后小肠中部分乳杆菌种类消失，同时梭菌属和紫单胞菌属等不常见菌群的出现。结论溃疡性结肠炎大鼠胃、小肠、结肠中有益菌乳杆菌明显减少，普氏菌属、紫单胞菌属、梭菌属等明显增多，这些菌属可作为条件致病菌引起内源性感染，可能是造成溃疡性结肠炎的重要原因。

自体脂肪移植在额颞部凹陷填充中的应用及其并发症分析

目的:探讨自体脂肪移植在额颞部凹陷填充中的应用疗效并对其并发症进行分析。方法:120例患者,采用大腿内侧肿胀麻醉,抽取大腿根部内侧自体脂肪并过滤纯化,将纯化后的自体脂肪均匀注射于额颞部,观察其临床效果。结果:本组120例,术后随访6~10个月,110例患者对术后效果满意;9例自觉改善不明显行二次注射,其余均为一次注射;1例因术后染发出现术后感染,经引流、换药后好转,其余均未出现脂肪液化、感染、坏死等并发症。结论:自体脂肪移植应用于额颞部凹陷填充,疗效确切,并发症可控,值得临床推广应用。

种植年限对杭白芍根际细菌群落及芍药苷含量的影响

为探寻栽培年限对杭白芍根际细菌群落及芍药苷含量的影响,揭示根际土壤微生态与杭白芍品质的关系,收集了1～4年杭白芍的根及根际土壤,利用PCR-DGGE检测土壤菌群多样性;利用HPLC检测根中芍药苷含量。结果表明,种植杭白芍能明显降低土壤的酸性,并随着栽培年份增加pH酸性持续下降,到第4年时土壤pH、酶活均达到最高,而有机质含量则最低。变性凝胶梯度电泳检测1～4年的根际细菌多样性在3.38～3.61,多样性随栽培年限而上升,说明杭白芍的生长会促进土壤中的细菌多样性。测序结果表明,杭白芍土壤中的优势细菌为γ变形菌、α变形菌、放线菌、酸杆菌及厚壁菌等,其中,根际特异菌主要为α变形菌、酸杆菌Gp1及放线菌;而在非根际土中γ变形菌为特异优势菌群。此外,1～4年的杭白芍根际优势细菌组成基本相似,只有少数种类随年份发生改变,表明根际细菌群落的组成主要受杭白芍物种的影响。HPLC检测结果表明,1～4年杭白芍的芍药苷质量分数分别为3.26%,3.30%,3.36%,3.41%,均超过国家标准,且随生长年份呈上升态势,但无显著性差异。相关性分析可知,芍药苷含量与土壤pH、细菌多样性呈显著正相关,与有机质呈显著负相关。与其他有连作障碍的作物不同的是,随着栽培年限的延长,杭白芍根际的pH和细菌多样性不降反升,但优势菌群变化不大,这可能是该植物不产生连作障碍的原因之一。研究表明,农业实践中之所以选择4年采收杭白芍根入药的原因之一主要是产量而不是有效成分含量。此外,研究还发现有效成分芍药苷的累积与土壤pH、有机质和细菌多样性关系密切,证明杭白芍的道地性与土壤微生态环境密切相关。

不同条件下连作杭白菊内生菌群的T-RFLP分析

通过研究轮作以及有机肥处理对连作杭白菊各器官内生细菌多样性和优势菌属的影响,揭示轮作和有机肥在缓解杭白菊连作障碍中的作用,筛选能够增强连作白菊抗病能力的有益内生菌。实验共设4个处理组,分别为连作处理、轮作处理、连作后施自制蚕沙发酵有机肥处理以及连作后施市售菌肥处理,通过基于16S r DNA的末端标记限制性片段长度多态性技术(terminal restriction fragment length polymorphism,T-RFLP)分析这些处理对杭白菊各器官内生细菌多样性及优势菌属的影响。结果显示,HaeⅢ内切酶能产生更多的TRFs数,比Hinf I酶更适合用来分析杭白菊内生菌多样性。有机肥和菌肥处理组的内生菌Simpson指数与轮作组相近,均高于连作,说明土壤外源微生物的添加导致植物内生菌多样性提高。实验共筛选出18种优势菌属,包括3种厚壁菌、4种放线菌和11种变形菌,其中节杆菌属、链霉菌属、黄杆菌属和分支杆菌属等优势菌属均在轮作组和菌肥组中检测到,而连作组中缺乏,说明添加外源微生物与轮作处理对杭白菊的内生菌群的影响基本类似,同时也说明这些菌的增加可能会通过影响连作白术的生长来缓解连作障碍。此外,比较不同器官中的内生菌的多样性及优势菌数量发现,根中最高,茎次之,叶中最少,这与内生菌侵入植株方式有关。总之,连作导致杭白菊内生细菌多样性降低,而轮作和菌肥处理后均能通过增加土壤微生物的多样性水平从而使连作杭白菊内生细菌多样性提高,最终达到缓解白菊连作障碍的目的。

利用DGGE和454测序研究不同浙贝母种源对根际土壤真菌群落的影响

探讨不同种源浙贝母根际真菌群落多样性差异,以了解浙贝母的土壤微生态机制。利用变性凝胶梯度电泳(DGGE)和454焦磷酸测序技术检测不同种源浙贝在同一块地种植其根际真菌的多样性及组成。DGGE结果表明,本地种源(宁波种)根际真菌Shannon指数高于南通和磐安种源。测序结果显示宁波产地的浙贝根际真菌主要由子囊菌、半知菌、接合菌以及一些未知真菌组成。其中,3个种源根际大部分真菌种类相同,但每个种源均有特异性真菌。454测序结果发现磐安本地种真菌多样性高于宁波和南通等外地种,与DGGE结果相同,这可能是本地种进化适应的结果。磐安实验地的根际土真菌包括Fungi_incertae_sedis,Ascomycota,Mucoromycotina,Basidiomycota,Chytridiomycota等10个门,其中前5门几乎占据了整个群落的90%,其真菌的种类和数量均超过宁波实验地,充分显示出产地的差异以及宏基因组测序的优越性。磐安种根际真菌隶属于10门29科28属159种,宁波种6门20科19属136种,南通种8门37科47属289种,非根际土则隶属于7门25科24属102种。其中Dothidea,Capnobotryella,Conidiobolus等属仅存在南通种,而Pyrenochaeta,Glomus,Pseudonectria等则只存于磐安种,暗示这些真菌的存在与浙贝母相关。种源和产地实验发现本地种的真菌多样性高于外地种,每个种源根际均有特异性真菌,说明根际真菌多样性及组成是由浙贝母种源和产区的土壤类型共同决定,而这些真菌等微生物通过与土壤-根际微生态系统的互作,反过来会进一步影响浙贝母的生长。

不同污水中细菌多样性DGGE检测

目的比较工业、农业和生活污染源河道内细菌群落的多样性,探讨环境与细菌群落多样性关系,为修复水环境技术提供理论依据。方法采集浙江省杭州市未污染的虎跑山泉水和3个不同污染源的水样共70份,用传统微生物平板培养和变性梯度凝胶电泳(DGGE)技术分析不同水体细菌群落的多样性差异。结果未被污染的虎跑山泉水p H最小,为7.25,其余受到污染的水体p H均>7.4,滨文河的p H最高,达8.04;浦沿化工厂河道中存在可培养的细菌最多,达到821 CFU/m L,其次为萧山养牛河道,虎跑最低仅8 CFU/m L,其细菌总数与p H密切相关;6种受污染的水中均存在大肠埃希菌和葡萄球菌,生活污水中未检测到沙门菌,化工污水中未检测到粪链球菌;变性梯度凝胶电泳结果表明,受污染的水中主要有变形菌门(23条带,71.9%)、放线菌门(8条带,25%)和厚壁菌门(1条带,3.9%),变形菌门是绝对的优势菌群;不同污染源影响的水中均有特异性细菌条带T5(uncultured bacterium clone C-84,HQ860591)和T7(uncultured rhodocyclaceae bacterium clone D7N55,KC006201),隶属于β-变形菌,只在受化工污染的河水中检测到;而受生活污水污染的河水中特有条带T3和T4均为γ-变形菌的气单胞菌属Aeromona;T10、T29和T30为受畜牧养殖场污水影响的河水中所特有,均隶属于放线菌门Gordonibacter属。结论不同的污染直接影响水的p H及细菌群落分布,且污水中致病菌也存在差异。