薄壳山核桃SSR-PCR体系优化及引物筛选

【目的】为建立薄壳山核桃SSR-PCR的最佳反应体系,筛选薄壳山核桃高多态性SSR引物,为薄壳山核桃构建指纹图谱、亲缘关系分析、品种鉴定等后续的相关研究提供有力工具。【方法】采用单因素试验与L_(16)(4^(5))正交试验设计相结合的方法,以薄壳山核桃DNA作为模板,对影响薄壳山核桃SSR-PCR反应体系中的6个影响因素(DNA、Mg^(2+)、10×PCR Buffer、引物、Taq酶、dNTPs)进行单因素试验,根据单因素试验的结果确定各影响因素的适宜用量范围,再据此设计正交试验。【结果】根据正交试验扩增结果,确立薄壳山核桃的最佳反应体系(10μL)为:Taq酶0.15 U,Mg^(2+)2.0 mmol/L,dNTPs 0.1 mmol/L,引物1.0μmol/L,50 ng模板DNA 1.0μL,10×PCR Buffer 1.0μL,ddH_(2)O5.8μL。5个因素影响薄壳山核桃SSR-PCR反应体系的扩增效果,其影响程度大小依次为Taq酶>引物=DNA>Mg^(2+)>dNTPs。以8种薄壳山核桃DNA为模板,4对薄壳山核桃引物对优化后的薄壳山核桃SSR-PCR反应体系进行验证,均扩增出明亮清晰的条带,证明优化后的反应体系稳定可靠。利用优化后的反应体系在283对核桃及山核桃引物中筛选出高多态性薄壳山核桃引物12对,其多态性位点信息数均高于0.5。【结论】优化后的反应体系及筛选出的12对薄壳山核桃引物可直接用于后续的SSR分子标记试验,为薄壳山核桃亲缘关系鉴定、交配系统分析等研究奠定理论基础。