日本鳗鲡TLR21基因的鉴定、免疫应答与启动子分析

为研究TLR21(Toll like receptor 21)在低等脊椎动物中的功能及表达调控机制,我们扩增获得了日本鳗鲡TLR21(Aj TLR21)c DNA序列,其编码的蛋白具有TLR家族的共同特征。Aj TLR21基因结构与其他鱼类和两栖类TLR21相同,由单个外显子编码。荧光定量结果显示,Aj TLR21在血液、鳃、脾脏、中肾等11个组织/器官中转录表达,其中在血液中表达量最高。经Poly I:C诱导后8h,Aj TLR21在脾脏和中肾中的表达量显著性上调;诱导后16h,Aj TLR21在血液、鳃、肠和脾脏中的表达量显著性上调(P<0.05)。双荧光素酶报告基因结果显示,在Aj TLR21 5′上游调控序列–1179 bp到+117 bp存在Poly I:C调节的正调控元件。经Edwardsiella tarda诱导后16h和72h,Aj TLR21分别在血液和中肾组织的表达量显著性上调,表明Aj TLR21同时也参与了抗细菌免疫应答,其在机体免疫系统中的功能具有多样性。研究对于理解日本鳗鲡Aj TLR21的免疫学功能具有重要的理论意义和应用价值。

日本鳗鲡IFN-γ基因的鉴定、表达模式及启动子活性分析

为揭示鱼类IFN-γ的生物学功能,研究从日本鳗鲡(Anguilla japonica)中克隆获得了IFN-γ基因,命名为Aj IFN-γ。Aj IFN-γ具有脊椎动物IFN-γ的典型特征:包括4外显子/3内含子的基因结构、C端的IFN-γ特征性氨基酸基序和1个核定位信号,以及6个α-螺旋反向平行构成的二级结构。Aj IFN-γ在日本鳗鲡所有组织中均低水平转录表达,其中肝脏中表达量最高,其次是皮肤和头肾。Poly I:C刺激和迟缓爱德华氏菌感染均可显著诱导Aj IFN-γ在鳃、头肾、体肾和(或)脾脏中的转录表达,表明Aj IFN-γ能够参与日本鳗鲡抗菌和抗病毒的免疫过程。此外,研究还克隆了Aj IFN-γ基因的5′调控区序列共1536 bp,并构建了一系列Aj IFN-γ5′调控区删节突变体,分析其启动子活性,结果表明,上游–240/+136区域中含有起始Aj IFN-γ转录的关键启动子调控元件,–1062/–814区域存在转录的正调控元件,而–1252/–1062区域存在转录的负调控元件。上述结果进一步丰富了鱼类IFN-γ的基础知识。

日本鳗鲡COX-2基因的克隆、鉴定及表达分析

应用PCR及RACE技术从日本鳗鲡(Anguilla japonica)中克隆获得一个2463 bp环氧化酶基因(Cyclooxygenase-2,AjCOX-2)的cDNA序列.AjCOX-2前体为606肽,含有脊椎动物COX-2的保守结构域,以及加氧酶和过氧化物酶的活性位点.在正常生理条件下,AjCOX-2基因在日本鳗鲡的鳃、鳔和皮肤中高水平转录表达.脂多糖刺激后8 h,AjCOX-2基因在皮肤和鳔中的转录表达显著上调(P<0.05);多聚胞苷酸刺激后8 h,AjCOX-2在皮肤、鳔和鳃中的转录表达显著上调(P<0.05);迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)刺激后8 h,AjCOX-2在鳔中的转录表达也极显著上调(P<0.01).结果表明,AjCOX-2基因是对外来病原刺激的早期响应基因,参与机体抵抗外来刺激物的先天免疫应答.