尖孢镰刀菌Six1d启动子的克隆及其在真菌分泌表达载体构建中的应用

前期研究中构建的真菌分泌表达载体p74HSP-EGFP可在真菌中表达目标蛋白,在真菌侵染并定殖植物的过程中分泌目标蛋白到植物中,从而验证目的基因的功能,但p74HSP-EGFP载体中驱动目的基因表达的毒素基因(toxin A,ToxA)启动子不是尖孢镰刀菌古巴专化型(Fusarium oxysporum f. sp. cubense, Foc)自身的启动子。为能在Foc中更有效地表达其自身基因,本研究从尖孢镰刀菌1号生理小种(Foc1)中克隆到高丰度表达的木质部分泌蛋白基因(secreted in xylem 1d, Six1d)的启动子,来替换p74HSP-EGFP载体中的ToxA启动子,并将新构建的真菌分泌表达载体命名为pSix1d74HSPG。为比较2个分泌载体的表达效率,本研究进一步将p74HSP-EGFP和pSix1d74HSPG载体转化尖孢镰刀菌热带4号生理小种(Foc TR4),获得的转化菌株分别在钾盐液体培养基(KK)中振荡培养5 d后,检测分泌到胞外的EGFP荧光强度和EGFP蛋白的表达量。结果显示,pSix1d74HSPG中Six1d启动子驱动的EGFP表达强度能够达到p74HSP-EGFP中ToxA启动子驱动的1.6~1.7倍,说明pSix1d74HSPG载体可代替p74HSP-EGFP载体在Foc中更高效分泌表达目的蛋白,为香蕉枯萎病抗感病分子机理研究提供重要的实验工具。

方斑东风螺配合饲料中锌的添加量研究

在含101 mg/kg锌的实用基础饲料中,分别加入0、30、60、90、120和150 mg/kg锌,饲喂初质量为（2.65~2.95）g的方斑东风螺幼螺10周。结果表明：饲料中添加锌,对方斑东风螺的增重率有显著影响,添加30 mg/kg时增重率最大,显著高于对照组。但添加锌没有影响螺的壳增长率、成活率和饵料系数。添加锌对方斑东风螺软体部粗蛋白、脂肪、灰分和水分有一定影响。软体组织锌含量受到饲料锌水平的显著影响,且与饲料锌含量呈正相关y=0.156 3x＋9.254 5,R^2=0.940 4。以增重率为指标,建议在方斑东风螺的实用饲料中,应添加30 mg/kg锌,锌的总含量约130 mg/kg。

红树叶蛋白质样品制备方法的比较及其双向电泳分析

采用水溶液提取法(磷酸盐缓冲液系统)、三氯乙酸-丙酮沉淀法和Phenol改良提取法,对红树叶进行蛋白质提取,并比较分析了这3种方法的蛋白质提取率、完整性、溶解性等。结果表明:水溶液提取法得到的是胶状沉淀,基本为多糖类物质,蛋白质含量很低;三氯乙酸-丙酮沉淀法提取的蛋白质纯度较高,但双向电泳背景最低,提取率较低,蛋白质的完整性差;Phenol改良提取法的蛋白质提取率高,约为三氯乙酸-丙酮法的10倍,双向电泳凝胶背景比三氯乙酸-丙酮沉淀法要深,蛋白质的完整性好,能够被电泳分离的蛋白质点是三氯乙酸-丙酮沉淀法的7倍左右。Phenol改良提取法在蛋白质的提取率以及完整性方面远远高于其他2种蛋白质提取方法。

安祖花茎段培养与离体繁殖

安祖花嫩茎切段离体培养的结果表明 ,基本培养基都以改良的MS为最好 ;初代培养试验的四种激素浓度配比 ,均能诱导切段脱分化形成愈伤组织 ,诱导率最高的组合为改良MS +BA 1.0mg·L 1,诱导率达 88.17% ,培养 3 0d ,愈伤组织块的直径超过 1cm。愈伤组织转接于改良MS +BA 0 .8mg·L 1+NAA 0 .0 5mg·L 1培养基上 ,丛生芽的分化率在 80 %左右 ,丛芽月增殖系数为 2～ 3。将 1cm以上的小芽切下转接于改良MS +IBA 0～ 0 .1mg·L 1或NAA 0 .1mg·L 1促生根培养基上 ,6～ 7d发根形成完整植株。移栽基质以蛭石、椰糠、碎花泥为好 ,成活率在 85%以上。

抗菌肽B基因的点突变及在昆虫细胞中的表达

抗菌肽Ｂ基因经ＰＣＲ定点突变技术改造后，克隆到杆状病毒转移载体ｐＡｃＧＰ６７Ｂ中的信号肽位点上，随后与野生ＡｃＮＰＶ－ＤＮＡ共转染Ｓｆ９细胞，经空斑筛选、ＰＣＲ检测证实获得含该基因的重组病毒。重组病毒在Ｓｆ９细胞中扩增并表达抗菌肽Ｂ基因。取含表达产物的细胞培养液检测其生物活性表明：改造过的抗菌肽Ｂ基因在Ｓｆ９细胞中获得初步表达，且表达的分泌型产物对ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＫ１２Ｄ３１有抑菌活性。

木薯14-3-3蛋白家族成员MeGRF3基因的原核表达及多克隆抗体制备

14-3-3蛋白是植物体内重要的信号转导调节分子,在碳代谢、逆境胁迫响应、生长发育等过程中发挥重要调控作用。为了深入解析14-3-3蛋白家族在木薯中的生物学功能,该研究采用酶切连接方法构建木薯14-3-3蛋白家族成员MeGRF3的原核表达载体,用热激法转化大肠杆菌Rosetta(DE3)株系,诱导表达带有MeGRF3的融合蛋白;使用纯化后的MeGRF3融合蛋白免疫新西兰公兔制备多克隆抗体,并检测抗体的效价和特异性。结果显示:(1)成功构建了木薯MeGRF3的原核表达载体pET-30a-MeGRF3,并诱导表达得到带有MeGRF3和6个His标签的融合蛋白。(2)MeGRF3融合蛋白主要以包涵体的形式存在,相对分子质量约为33 kD。(3)间接酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)测定的抗体效价为1024000。(4)Western blot分析显示,木薯叶片、茎尖、茎皮和块根中均检测到与MeGRF3蛋白大小一致的条带,说明MeGRF3在这4个组织器官中均表达,但主要是在茎尖和块根中大量积累,表明该研究成功制备的MeGRF3多克隆抗体的特异性较好。

盐芥叶片应答盐胁迫的蛋白质组学分析

盐芥是研究耐盐机理的模式植物。为从蛋白质水平揭示盐芥响应盐胁迫的分子机制,本研究采用同位素标记相对和绝对定量(iTRAQ)技术对不同NaCl浓度处理7 d的盐芥叶片进行差异蛋白质组学分析。结果表明,盐芥叶片中共鉴定到4607个蛋白质,其中281个蛋白质的表达丰度显著增加,95个蛋白质的表达丰度显著降低。盐胁迫差异表达蛋白质的KEGG代谢通路和蛋白质互作网络分析结果表明,促进植株光合作用可帮助盐芥适应低盐环境;抑制叶绿素和支链氨基酸合成、调控应激反应基因的表达是盐芥应对中盐环境的重要因素;而有效清除活性氧、提高渗透物质积累量和增加能量供应可能是盐芥耐受高盐环境的关键。本研究结果为揭示盐芥应答盐胁迫的分子响应机制提供了理论基础。

无核荔枝胚胎发育时期蛋白质图谱分析

通过二维聚丙烯酰胺凝胶电泳(2DE)以及计算机辅助的图像分析技术,对荔枝开花后20d的正常与败育胚蛋白质图谱进行了初步分析。结果表明,正常胚总蛋白质斑点数为129,败育胚总蛋白质斑点数为130,其中24个蛋白质点在两种胚中的表达丰度没有明显变化,35个蛋白质点在表达丰度上有明显差异,55%的蛋白则发生了蛋白质缺失、增加以及位置改变等变化。这两种蛋白质组的表达差异说明了胚内蛋白质成分在其败育过程中发生了变化,这些蛋白可能参与了胚败育的调节和控制。

西番莲双受精过程的细胞学观察

利用石蜡制片 ,观察了西番莲双受精的全过程 ,其主要结果如下 :人工授粉后 6.5小时 ,大量花粉管进入子房腔 ,并沿子房内壁生长 ,进行珠孔受精 ;7～ 7.5小时 ,花粉管由珠孔进入胚囊 ,破坏一个助细胞 ,释放出二个精子 ;7.5～ 9小时 ,大多数胚珠雌、雄性核发生融合。其受精作用属于有丝分裂前型的配子融合类型 ;精子与卵细胞、精子与极核融合几乎同时发生 ,两极核于受精后融合 ;合子与初生胚乳核无休眠期 ,受精后立即进行有丝分裂。

转基因甘蔗对根际土壤微生物多样性的影响

应用Biolog法研究了转几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶基因甘蔗对根际土壤微生物多样性的影响。结果表明：转基因甘蔗根际土壤微生物利用单一碳源能力（AWCD）要高于非转基因甘蔗的根际土壤微生物；转基因甘蔗和非转基因甘蔗根际土壤样品的Simpson指数（1/D）、Shannon-Wiener指数（H）、Mclntosh指数（U）均存在差异，其中转基因甘蔗根际土壤微生物的Simpson指数显著高于非转基因甘蔗土壤微生物，两种土壤微生物群落优势度的差别很大，其次是Mclntosh指数（U）指数，丰富度的差别不是很大。说明转基因甘蔗根系在生长期的分泌物刺激根际土壤微生物群落的生长，可能诱导了具有某些特定生理特征的微生物群落的发展，因此转基因甘蔗对根际土壤微生态有一定的影响。

转无机焦磷酸化酶基因甘蔗对根际土壤微生物群落多样性的影响

应用Biolog Eco微平板法研究了转无机焦磷酸化酶基因甘蔗对根际土壤微生物多样性的影响。结果表明:转基因甘蔗根际土壤微生物利用单一碳源能力(AWCD)在整个培养过程都显著高于非转基因甘蔗的根际土壤微生物;转基因甘蔗和非转基因甘蔗根际土壤样品的Simpson指数(1/D,优势度)、Shannon-Wiener指数(H,物种丰富度)、Mclntosh指数(U,物种均一性)均存在差异,其中转基因甘蔗根际土壤微生物的Simpson指数、Mclntosh指数均显著高于非转基因甘蔗土壤微生物;主成分分析也表明转基因甘蔗与非转基因甘蔗土壤微生物对不同的碳源有特异利用,起分异作用的主要碳源是糖类,其次是脂肪酸和脂类。表明转基因甘蔗根系在生长期可能诱导了具有某些特定生理特征的微生物群落的发展,因此改变了土壤微生物群落的功能多样性,总体表现较高的活性。

醮核荔枝胚胎发育相关蛋白质的分离及初步鉴定

通过二维聚丙烯酰胺凝胶电泳以及计算机辅助的图像分析技术,对荔枝开花后40 d的正常与败育胚蛋白质图谱进行初步分析。结果表明,100个蛋白质点在表达丰度上有明显差异;选择仅在正常发育胚胎胶上表达的蛋白点15个和仅在败育胚胎胶上表达的蛋白点50个,进行基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MASS)分析,鉴定出9个与胚发育相关的蛋白,这些蛋白可能参与了胚败育的调节和控制。

利用Taq DNA聚合酶反转录cDNA第一链的研究

应用ＴａｑＤＮＡ聚合酶（ＴｈｅｒｍｕｓａｑｕａｔｉｃｕｓＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）直接对ＲＮＡ进行反转录成ｃＤＮＡ第一链，然后用特异引物进行ＰＣＲ扩增，结果表明，反转录达到ＡＭＶ逆转录酶的效果，且可能得到比ＡＭＶ逆转录酶更完整的ｃＤＮＡ第一链。

香蕉束顶病毒海南分离物DNA2编码区的克隆及抗血清的制备

利用PCR方法克隆香蕉束顶病毒海南分离物(Banana bunchy top virus,BBTV-HN)DNA2编码区,将其插入到原核表达载体pGEX-6p-1谷胱苷肽-S-转移酶(GST)基因下游。所得克隆pGEX-HN-B2测序结果表明,插入的DNA2片段为267bp,且表达相位和理论上设计的完全一致。把此重组质粒转化到E.coli Rosetta(DE3)中,经过异丙硫代半乳糖苷(IPTG)诱导后出现约33Ku融合蛋白质表达条带。为获得特异的血清,切下目的表达条带并免疫兔子。经Western-blotting检测,获取的血清可以和表达的33Ku融合蛋白特异结合,表明已成功获得DNA2编码蛋白的血清。

双价抗菌肽基因表达载体的构建

将人工合成的抗菌肽Ｄ基因和抗菌肽Ｂ基因克隆到同一植物表达载体ｐＢⅠ１２１，且各自具有其３５ｓ启动子和Ｎｏｓ终止子。先将抗菌肽Ｄ基因及其启动子和终止子克隆到ｐＢ１２１ＨｉｎｄⅢ位点获得ｐＥＣＶⅠ重组子。然后将抗菌肽Ｂ基因克隆到ｐＥＣＶⅠ的ＢａｍＨⅠ位点，经Ａｇａｒｏｓｅｇｅｌ检测和酶切鉴定获得具有抗菌肽Ｄ，抗菌肽Ｂ基因的双价基因表达载体ｐＥＣＶⅡ。

转基因作物安全评价的检测技术

转基因作物的生物安全问题已成为全球的关注焦点,世界各国和各国际组织相继制定了相关的法律法规来加强转基因作物的安全管理。转基因作物的安全问题需要对其进行转基因生物安全评价,而转基因作物的检测评价技术是判定转基因作物是否安全的关键。笔者综述了当前转基因作物的主要检测技术和安全评价技术,重点阐述了非目标的组学技术包括转录组学、蛋白质组学和代谢组学,在转基因作物的非预期影响的安全评价中的应用。

棉花DNA提取方法综述

棉花是我国重要的经济作物之一,富含棉酚、多糖、单宁等其他干扰物质,因此其DNA的提取和纯化较其他作物更为困难。文中对棉花DNA提取方法进行了讨论,其中SDS法和CTAB法是常用的2种提取方法,而CTAB法及其改良法提取的效果最好。

橡胶树遗传多样性RAPD分析技术各参数选定的研究

用两种不同的方法提取橡胶叶片总DNA，结果表明：以SDS法提取的DNA更能满足对橡胶树进行大量RAPD分析的要求，其PCR扩增产物稳定，分别以不同的复性温度、变性和复性时间、循环数、DNA模板量和不同的Tag酶量进行比较实验．结果表明：以94℃变性1min和36℃复性1min、72℃延伸2min，DNA模板量为25～100ng，Tag酶量为1～1．5U．共进行45个循环为最适的PCR参数，能够得到清晰的扩增条带，且重复结果稳定一致。

生命的自组织

以耗散结构理论为基础，从生命的平衡和不平衡，生命的有序和无序以及生命的自组织等三个方面对生命的发生，发展及死亡的过程进行探讨，尤其对生命的自身防卫机制以及药物对疾病的治疗作用等从理论上进行了分析和探讨。