FAdV-4 NP株F1蛋白原核表达及多克隆抗体的制备

根据FAdV-4 NP株F1蛋白编码框的主要抗原位点,设计一对特异性引物,经PCR扩增、测序,分析表达效率后,进行密码子优化,以合成的新序列作为模板,构建重组表达质粒pET-32a-F1,将质粒转化到BL21中,筛选诱导条件,Western blot鉴定表达产物,将待纯化蛋白依次经过不同浓度的咪唑洗脱,纯化重组蛋白,最后将纯化后的蛋白免疫新西兰黄兔,收集血清并用间接ELISA法测定抗体效价.结果表明,所设计的特异性引物扩增了一条约699 bp的片段.PCR验证和酶切鉴定表明,pET-32a-F1被成功构建,并能够高效表达.重组质粒pET-32a-F1诱导的最佳IPTG浓度为0.3 mmol·??L^-1,最佳诱导时间为5 h,最佳诱导温度为37℃,咪唑洗脱浓度为80 mmol·??L^-1时,能获得较单一的洗脱蛋白.此外,本试验制备的F1多克隆抗体的效价可达1∶1 024 000.

猪圆环病毒3型夹心ELISA诊断方法的建立

本研究基于实验室制备的PCV3 Cap蛋白单克隆抗体,建立检测PCV3的夹心ELISA方法。通过筛选最佳包被浓度、包被时间、一抗和二抗浓度来建立夹心ELISA方法并确定临界值。探讨该方法的特异性和重复性,并进行临床应用。结果表明,单抗包被10μg/mL(1:200)、一抗1:4 000稀释、二抗1:5 000稀释后的作用浓度为最佳工作浓度;特异性试验表明,该诊断方法特异性良好,与PCV2等多种病毒蛋白不存在交叉反应;重复测试结果表明,测定内和测定间的变异小于5%。研究结果表明,建立的夹心ELISA试验可用于临床检测PCV3。

鸡腺病毒血清4型变异株荧光定量PCR检测方法的建立

为建立一种快速、灵敏的Ⅰ群鸡腺病毒血清4型(FAdV4)变异株检测方法,针对FAdV4变异株NP株Hexon基因的保守序列设计1对特异引物,通过荧光定量PCR(QPCR)反应体系的优化,建立了FAdV4的QPCR检测方法。结果显示:该方法特异性强,除FAdV4变异株外均无其他非特异扩增;此外,该方法敏感度高,其检测下限为53.9 copies/μL;组内、组间变异系数均小于5%,重复性好。临床样品检测结果显示,建立的QPCR方法的FAdV4变异株检出率为56.5%,远高于常规PCR的检出率(21.7%)。可见,建立的QPCR方法可用于临床快速检测FAdV4变异株。