瘦素激活PI3K/AKT信号促进小鼠心肌细胞衰老的初步研究

目的:探讨瘦素在小鼠心肌细胞(mouse cardiomyocyte,MCM)衰老中的作用及调控机制。方法:qPCR检查瘦素刺激后MCM中衰老相关指标p16、p21和衰老相关分泌表型(senescence-associated secretory phenotype,SASP)的mRNA表达量;Western blot检测p16、p21、γ-H2AX、PI3K、AKT、p-PI3K和p-AKT的蛋白表达量;β-半乳糖苷酶染色检测MCM衰老。PI3K抑制剂(LY294002)预处理2 h后再给予瘦素刺激,qPCR和Western blot检测p16和p21的m RNA和蛋白表达水平;qPCR检查SASP的mRNA表达水平;β-半乳糖苷酶染色检测MCM衰老。结果:瘦素刺激MCM后,p16和p21的m RNA及蛋白表达增加,同时γ-H2AX的蛋白水平也显著上升,SASP[白介素(interleukin,IL)-1β、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)-α、IL-6和单核细胞趋化蛋白(monocyte chemoattractant protein,MCP)-1)]的mRNA水平上调,PI3K/AKT信号通路的蛋白磷酸化水平升高,β-半乳糖苷酶染色显示MCM发生衰老。PI3K抑制剂预处理2 h后,p16和p21的m RNA和蛋白水平明显降低,同时γ-H2AX的蛋白水平也显著下调;SASP mRNA水平降低;β-半乳糖苷酶染色显示MCM衰老缓解。结论:瘦素通过活化PI3K/AKT信号通路分泌SASP(IL-1β、TNF-α、IL-6和MCP-1)调控MCM衰老的发展进程。

调整校点布局 推进均衡发展

近年来，在内江市学校布局结构调整这一“大动作”中，资中县是调整中的“先行者”“排头兵”，取得了可圈可点的成绩。

地铁车站结构施工的质量问题及对策

针对地铁车站工程结构施工中易出现的质量问题,结合北京地铁10号线芍药居站施工,论述施作聚乙烯丙纶复合防水卷材、止水带等防水材料时容易出现的质量问题,分析其中的原因并对所出现的问题提出相应的预防措施:从模板采用的材质、水化热、混凝土的收缩变形等几个方面对混凝土产生裂缝的原因进行分析,提出了自己的见解,为防止裂缝提供了一些有益的经验。

大鼠S100A8基因启动子质粒的构建及其SOX7结合元件的初步鉴定

目的:构建大鼠S100钙结合蛋白A8(S100A8)基因启动子荧光素酶报告质粒,并在HEK-293T中检查过表达性别决定区Y框蛋白7(SOX7)基因对S100A8启动子活性的影响,同时筛选可能的SOX7结合元件。方法:采用PCR技术扩增大鼠S100A8启动子全长,经双酶切后连接到pGL3-basic中,命名为pGL3-S100A8-FL。将pGL3-S100A8-FL与前期构建的pIRES2-SOX7质粒共转染HEK-293T,再测定荧光素酶活性。此外,运用JASPAR预测S100A8启动子区可能包含的SOX7结合元件,并依此构建4个启动子截短质粒(即pGL3-S100A8-1~4)。将pGL3-S100A8-FL和pGL3-S100A8-1~4分别与pIRES2-SOX7共转染HEK-293T,检查荧光素酶活性。接着构建SOX7结合元件突变的S100A8启动子质粒(即pGL3-S100A8-M),与pIRES2-SOX7转染HEK-293T,检测其荧光素酶活性。结果:将pGL3-S100A8-FL与p IRES2-SOX7共转染HEK-293T,发现过表达SOX7可显著增加pGL3-S100A8-FL启动子活性。将pGL3-S100A8-FL和pGL3-S100A8-1~4分别与p IRES2-SOX7共转染HEK-293T,发现pGL3-S100A8-4启动子活性显著低于pGL3-S100A8-FL和pGL3-S100A8-1~3,提示SOX7与S100A8启动子结合元件可能位于-200~+51 nt区域内。将-86~-57 nt元件突变质粒(pGL3-S100A8-M)或pGL3-S100A8-FL与pIRES2-SOX7共转HEK-293T,发现pGL3-S100A8-M启动子活性显著低于pGL3-S100A8-FL。提示SOX7可能与S100A8启动子-86~-57 nt元件结合。结论:成功构建大鼠S100A8基因启动子全长、截短和突变荧光素酶报告质粒,并初步确定S100A8启动子区的SOX7结合元件。

NF-κB p65调控IRF-8基因启动子活性及其启动子结合元件的初步鉴定

目的:探讨大鼠核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)p65亚基在细胞内过表达和其活性变化对干扰素调节因子-8(interferon regulatory factor-8,IRF-8)基因启动的影响,并初步筛查IRF-8启动子上可能的p65结合元件。方法:采用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)技术扩增大鼠p65基因蛋白编码区(complete sequence coding,CDS)序列,将其插入到空载p IRES2-EGFP质粒中,构建大鼠野生型(wild type,WT)p65过表达质粒(pIRES2-p65 WT)。在此基础上,将p65第535位丝氨酸(serine,S)突变为天冬氨酸(aspartic,D)或丙氨酸(alanine,A),分别构建p65持续活化突变型质粒(pIRES2-p65 S535D)和p65显性负性突变型质粒(pIRES2-p65 S535A)。之后应用生物信息学软件预测IRF-8基因启动子区p65的结合元件,并据此构建IRF-8启动子全长(full-length,FL)和3个截短的荧光素酶报告质粒,即pGL3-IRF-8-FL(-1892^+174 nt)、pGL3-IRF-8-1(-1360^+174 nt)、pGL3-IRF-8-2(-752^+174 nt)和pGL3-IRF-8-3(-68^+174 nt)。将上述质粒行不同组合共转染人胚肾293T(human embryonic kidney 293T,HEK-293T)细胞,Western blot和荧光素酶实验分别检查p65的表达和IRF-8的启动子活性,并分析IRF-8启动子区可能的p65结合元件。结果:菌液PCR及测序证实上述质粒构建成功。分别将pIRES2-p65 WT、pIRES2-p65S535D、pIRES2-p65 S535A和p GL3-IRF-8-FL共转染HEK-293T,发现过表达pIRES2-p65 WT或pIRES2-p65 S535D均可明显增加IRF-8启动子活性,且以pIRES2-p65 S535D更为显著;而过表达pIRES2-p65 S535A后,IRF-8启动子活性无明显变化。将pGL3-IRF-8-FL、pGL3-IRF-8-1~3和pIRES2-p65 S535D共转染HEK-293T后发现,pGL3-IRF-8-3的启动子活性显著低于pGL3-IRF-8-FL、pGL3-IRF-8-1和p GL3-IRF-8-2,提示大鼠IRF-8启动子-752~68 nt区域可能存在p65结合元件。结论:在HEK-293T细胞内过表达野生型或持续活化突变型p65可显著促进IRF-8基因的启动,且p65与IRF-8启动子的结合元件可能位于-752^-68 nt部位。

青藤碱对PKC-α/NF-κB-p65通路的抑制作用及机制

目的:探讨过表达蛋白激酶C-α(protein kinase C-α,PKC-α)对HEK-293T细胞中核因子-κB-p65(nuclear factor-κB-p65,NF-κB-p65)磷酸化水平的影响,并检查青藤碱(sinomenine,SIN)对PKC-α/NF-κB-p65信号通路的抑制作用。方法:采用PCR技术扩增大鼠PKC-α基因蛋白质编码区(complete sequence coding,CDS)序列,将其插入到pIRES2-EGFP空载质粒中,构建野生型(wide type,WT)PKC-α过表达质粒(pIRES2-PKC-α-WT,PKC-α^(WT));在PKC-αWT质粒的基础上,将PKC-α第25位丙氨酸(A)与368位赖氨酸(K)分别突变为谷氨酸(E)和精氨酸(R),即构建持续活化(constitutively active,CA)突变型PKC-α过表达质粒(pIRES2-PKC-α-A25E,PKC-α^(CA))和显性负性(dominant negative,DN)突变型PKC-α过表达质粒(pIRES2-PKC-α-K368R,PKC-α^(DN))。本课题组前期构建的大鼠野生型NF-κB-p65过表达质粒(pIRES2-NF-κB-p65,p65^(WT))分别与上述各PKC-α过表达质粒共同转染HEK-293T细胞,免疫印迹法检测PKC-α、NF-κB-p65的表达及磷酸化水平。再将上述不同质粒转染HEK-293T细胞,46 h后予50 ng/mL SIN处理细胞2 h,再行免疫印迹实验分析SIN对PKC-α、NF-κB-p65磷酸化的影响。结果:菌液PCR及测序证实,上述PKC-α过表达质粒构建成功。在HEK-293T中过表达PKC-αWT或PKC-αCA可促进NF-κB-p65的磷酸化,且过表达PKC-αCA时尤为显著,而过表达PKC-αDN后NF-κB-p65的磷酸化无明显变化。SIN处理可抑制PKC-α^(WT)、PKC-α^(CA)和PKC-α^(DN)转染组HEK-293T细胞中PKC-α的磷酸化,同时也能抑制过表达PKC-α^(WT)上调的NF-κB-p65磷酸化修饰,但不影响过表达PKC-αCA和PKC-αDN对NF-κB-p65的磷酸化作用。结论:过表达PKC-α可促进HEK-293T细胞中NF-κB-p65的磷酸化,SIN处理HEK-293T细胞后可通过抑制PKC-α的磷酸化下调NF-κB-p65的磷酸化修饰。

秦岭林区进行森林抚育的必要性分析

通过对秦岭林区天然林资源的调查和现状分析,从生态、经济、社会等方面阐述了对秦岭林区天然林进行抚育的必要性和紧迫性,对过去的经验进行了总结,并提出了存在的问题和解决方法。

波音737NG飞机发动机起动机故障诊断与分析

波音737NG飞机是第二代737的改进型飞机,不仅仅在系统上有了优化,并且整体也更加先进,维护起来更加方便,并且相较于第二代波音737的实用性和经济性也更高,这让波音737NG飞机的使用受到了广泛的欢迎,而同时,对波音737NG飞机的故障诊断工作也逐渐受到关注,针对发动机起动机故障而言,一旦对起动机的故障排查不到位,很可能造成难以挽回的损失。本文首先对波音737NG飞机发动机故障诊断原理进行总结,并详细介绍各种故障的排查与诊断方法,以期为波音737NG飞机发动机起动机的故障诊断提供参考。

GCN5调控sublytic C5b-9诱导大鼠肾小球系膜细胞表达Cyclin D1及致SOX9的乙酰化修饰

目的:探讨GCN5调控sublytic C5b-9刺激大鼠肾小球系膜细胞(glomerular mesangial cell,GMC)诱导Cyclin D1基因表达以及GCN5乙酰化修饰SOX9转录因子的作用。方法:先用Western blot检测Thy-1肾炎(Thy-1 nephritis,Thy-1N)大鼠的肾组织和sublytic C5b-9刺激的GMC中GCN5、SOX9和Cyclin D1的表达。然后分别将pIRES2-GCN5过表达和shGCN5小干扰质粒或将这些质粒与Cyclin D1启动子质粒行不同组合转染GMC,用荧光素酶报告基因实验和real-time PCR、Western blot检测过表达或沉默GCN5后对Cyclin D1表达的影响。同时用免疫共沉淀(Co-IP)和Western blot检测sublytic C5b-9刺激或分别转染GCN5过表达和酶活性突变质粒(ΔGCN5)的GMC中SOX9的乙酰化修饰。结果:Thy-1N大鼠肾组织和sublytic C5b-9刺激的GMC中GCN5、SOX9、Cyclin D1蛋白水平均明显上调,而过表达GCN5基因能上调Cyclin D1的启动子活性、mRNA和蛋白表达;敲低GCN5表达则得到了相反的结果。此外,sublytic C5b-9刺激和过表达GCN5基因促进了SOX9的乙酰化修饰,而沉默GCN5后则降低了SOX9的乙酰化水平。结论:GCN5可上调GMC中Cyclin D1的表达,并促进SOX9的乙酰化修饰。

为何英德矛盾是一战前夕帝国主义国家间的主要矛盾

19世纪末20世纪初,世界主要资本主义国家进入帝国主义阶段。由于经济政治发展不平衡,主要资本主义国家的实力对比发生了显著的变化:后起的美、德超过了老牌的英、法。

绿色在保护中长青——陕西省太白林业局公益林建设纪实

陕西省太白林业局位于秦岭山脉西部中段，林区森林覆盖率96．2％。实施天然林保护工程前，该局主要从事木材采伐和加工业，经过长期开采，森林资源急剧下降，生态环境恶化，引发了林业局“资源危机，经济危困”的局面，企业陷入了发展困境。