水稻红莲型细胞质雄性不育基因orfH79的表达对细菌生长的抑制

orfH79是水稻红莲型细胞质的雄性不育基因。为了进一步研究其分子机理,在大肠杆菌中分别构建水稻红莲型细胞质雄性不育基因orfH79的原核表达载体pET-28a-orfH79和pGEX5x-2-orfH79。分别转化大肠杆菌菌株BL21(DE3)后利用IPTG诱导分析其表达产物对细菌生长的影响,结果表明PET-28a-orfH79重组子诱导表达的微量的ORFH79天然蛋白强烈的抑制了细菌的生长,而pGEX5X-2-orfH79重组子诱导表达的在ORFH79蛋白N端带GST标签的融合蛋白对细菌的生长影响却并不明显。这一结果为思考水稻红莲型细胞质雄性不育的分子机理提供了研究线索。

水稻红莲型不育系花药败育过程中线粒体亚显微结构的观察及ORFH79蛋白的亚细胞定位

为了了解水稻红莲型细胞质雄性不育系小孢子发育过程中线粒体的结构特征以及水稻红莲型细胞质不育系基因orfh79蛋白的亚细胞的定位,利用透射电镜分别观察了红莲型性不育系水稻小孢子发育过程中花粉母细胞,四分体和单核期三个发育时期花药线粒体的超微结构的变化,并结合胶体免疫金电镜技术研究了orfh79蛋白的亚细胞的定位。结果表明,与育性正常的保持系(YtB)同期小孢子发育相比,水稻红莲型不育系(YtA)小孢子发育的四分体和单核花药期的线粒体的结构出现了异常。同时,胶体免疫金电镜结果表明orfh79蛋白集中分布于不育系花药的线粒体中。上述实验结果从细胞学角度为深入研究红莲型细胞质雄性不育的机理奠定了基础。

水稻OsRab7耐盐功能的初步鉴定及其表达载体的构建

Rab7是一个GTP结合蛋白，隶属于Rab家族，该家族在调控膜泡的运输、结合以及细胞内膜结构的组织中行使重要作用。本实验通过RT—PCR技术从盐敏感水稻品种‘日本晴’（‘Nipponbare’）获得了OsRab7基因全长序列，成功构建了原核表达载体pET-32a-OsRab7。在IPTG诱导下，该蛋白高效表达，并明显缓解了高盐环境（4．5％～8．5％NaCl）对大肠杆菌的生长胁迫。为进一步研究该基因的功能，将OsRab7在大肠杆菌中的表达蛋白纯化，并利用p1301B（pCAMBIA1301改造载体）构建了植物表达载体，成功转化来源于水稻株系‘中花11’（盐敏感）的愈伤组织，为探讨其在水稻中的表达模式和功能分析及应用于水稻耐盐品种的改良奠定了一定的基础。

红莲型水稻细胞质雄性不育花粉总蛋白质初步比较分析

采用固相pH梯度/SDS-PAGE双向电泳对红莲型细胞质雄性不育水稻的不育系(YTA)和保持系(YTB)二核期花粉总蛋白质进行了分离,通过银染显色,获得了分辨率和重复性较好的双向电泳图谱。用PDQuest2DE软件可识别约1500个蛋白质点,其中差异表达的蛋白质点数为120。将其中15个差异点采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(matrix assisted laser desorption/ionizaton time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF-MS)进行了肽质指纹图分析,通过采用Mascot软件对MSDB数据库查询,其中7个蛋白质点得到了鉴定。YTA相对于YTB有部分参与物质和能量代谢的蛋白质缺失或表达量降低,这些蛋白质分别是水稻线粒体H+-转运ATPase(H+-ATPase)α链、盐诱导型膜联蛋白、线粒体NAD+-依赖型苹果酶和磷酸核糖焦磷酸合成酶等。这些蛋白质的表达下调或缺失可能与线粒体提供能量不足而导致的花粉不能正常发育有关。线粒体电压依赖性阴离子通道(VDAC)这一重要蛋白质在YTA中的上调表达有可能与花粉败育过程中细胞的程序性死亡相关。

水稻花药总蛋白质双向电泳方法的改良与优化(简报)

双向电泳作为蛋白质组学核心技术之一．目前已广泛地应用在植物领域，并且成功应用于水稻代谢和调节等方面的研究。谢锦云等利用溶液法提取温敏核不育水稻花药总蛋白质．利用pH3—10线性胶条分离，经银染显色后检测到约1．000个点。本文通过对传统双向电泳方法进行改良和优化．得到了一种适合于分析水稻花药总蛋白质的双向电泳（two—dimensional electrophoresis．2DE）的方法，第一向采用固相胶条在等电聚焦分离．第二向采用SDS—PAGE分离。

水稻红莲型细胞质雄性不育系小孢子不同发育时期花药总蛋白质比较分析

采用双向凝胶电泳对水稻红莲型细胞质雄性不育的不育系小孢子发育单核期和二核期花药总蛋白进行了分离，通过银染显色，获得了分辨率和重复性较好的双向电泳图谱，且单核期和二核期花药总蛋白质在双向电泳胶上分布的图谱十分相似。PDQuest 2DE图像分析软件在等电点（pI）3．0—10．0、分子量（M．W．）9．0—98．0kD之间可识别约1800个蛋白质点。比较分析发现单核期和二核期花药中共有241个差异表达的蛋白质点，其中仅在单核期中表达的点数为125，仅在二核期中表达的为13点；表现为表达量差异的105点，其中在二核期表达下调的点数为70点，表达上调的为33点。还对蛋白质点集中的区域（p14．5—8．0，M．W．25．0—70．0kD）中的41个差异蛋白质点进行了分子量和等电点分析。

红莲型水稻杂种F1花药噬菌体展示文库的构建

噬菌体展示是研究蛋白质相互作用的重要手段,为深入研究红莲型水稻不育和育性恢复的分子机理,以红莲型水稻杂种F1花药为材料,分离纯化mRNA,经反转录合成双链cDNA,在双链cDNA末端加上定向EcoRⅠ/HindⅢ接头,再用EcoRⅠ和HindⅢ消化接头,形成两端分别带有EcoRⅠ和HindⅢ粘性末端的双链cDNA。经Mini Column纯化后,收集300bp以上的双链cDNA片段,将其连接到带有EcoRⅠ和HindⅢ末端的T7 Select 10-3b载体上,经体外包装后,以BL T5403为受体菌构建了红莲水稻杂种F1花药的噬菌体展示文库。经测定显示,该噬菌体展示文库容量为1.03×106pfu/mL,重组率为100%,扩增后文库滴度为2.14×1012pfu/mL。对随机挑取的100个噬菌斑进行PCR鉴定,97%的插入片段大于300bp。

促进学生HOTs研究性学习的应用研究——以“生物工艺原理”为例

面对信息化、学习化、智能化和个性化知识经济的新形势,如何培养学生的高阶思维能力(HOTs)是新课程改革应该关注的课题。围绕培养学生的高阶思维能力的目标,对网络环境下研究性学习的生物工艺教学设计各元素进行优化,探索出培养学生高阶思维能力的途径和方法。本文从案例选择、问题设计、教学实施、效果分析等方面探讨了其在生物工艺原理教学中的应用。实践证明,将网络环境下促进学生HOTs研究性学习的教学设计引入"生物工艺原理"课程,促进了学生对基础知识和总体知识的把握和理解,提高了学生的专业思维能力和独立思考能力。这将为本学科的教学改革提供参考。

植物基因打靶技术及其应用

对植物基因打靶技术的原理、操作程序、打靶效率的影响因素及其在植物中的应用现状进行了综述,并就如何有效地提高打靶效率提出了建议,同时对该技术在植物学研究领域中的应用前景进行了展望。

基于现代信息技术的“分子生物学实验”课程建设与实践

"分子生物学实验"作为生命科学领域基础课程,是一门实践性学科。该文通过论证,对教学内容进行更新,引进综合性实验,提升学生的综合能力;基于现代信息技术,对分子生物学实验课程教学进行了较大幅度的改革,以期取得更好的实验教学效果,提高学生运用知识的能力和科研素质。

肠道微生态失调对小鼠海马星形胶质细胞的影响

精神分裂症是一种多病因的精神疾病。流行病学研究表明,肠道微生物与精神分裂症发生有关。繁育了精神分裂症易感基因Nrg1基因敲除(Nrg1^(-/-))小鼠,用抗生素破坏野生型和(Nrg1^(-/-))小鼠的肠道微生物系统,通过观察肠道微生态失调对小鼠大脑海马区星形胶质细胞的影响,来研究肠道微生态与精神分裂症发生的关系。将20d的C57BL/6雄性小鼠随机分成4组:对照组、肠道微生态失调组、易感基因Nrg1/敲除组、肠道微生态失调与易感基因互作组,每组12只。处理30d后,采用免疫荧光技术定量分析各组小鼠大脑海马区星形胶质细胞的分布与形态。结果显示,肠道微生态失调和敲除易感基因Nrg1都能激活星形胶质细胞,细胞膨大(P<0.05),分支增多(P<0.01)。在一定程度上,肠道微生态失调与易感基因Nrg1交互作用加剧星形胶质细胞的活化(P<0.05)。

Gateway技术构建盐和干旱胁迫下水稻根系混合cDNA文库及其质量鉴定

为研究水稻非生物胁迫响应信号转导的网络途径,揭示水稻抗逆的分子机制,以NaCl胁迫、干旱胁迫处理及正常生长的水稻根系为材料,采用Gateway技术构建了水稻根系受盐和干旱诱导的混合cDNA文库.cDNA文库质量分析表明,未经扩增的原始文库容量为1.5×106 cfu,插入片段大小主要为1 kb左右,重组率为100%.文库随机挑选克隆测序,结果显示插入序列完整性良好,文库中包含水解酶基因、逆境响应蛋白基因、氧化还原酶基因和富含甘氨酸的RNA结合蛋白质基因等.因此,本研究构建的盐和干旱诱导的水稻根系混合cDNA文库符合高质量文库的标准,可以用于进一步开展相关基因的克隆及功能研究.

分子遗传学教学模式改革初探

分子遗传学是21世纪生命科学最有活力的学科之一,了解这门学科的前沿进展有利于加深学生对该专业的理解和开阔学生的科研视野。笔者在分子遗传学教学中开设了学生作学术报告专题课的内容,探索和建立了以教师为主导、学生为主体的自主协作学习的教学模式,锻炼了学生获取知识并应用知识的能力,取得了较好的教学效果。

红莲型杂交水稻细菌双杂交系统文库的构建

用Trizol试剂提取红莲型水稻杂种F1幼穗的总RNA,分离纯化mRNA后反转录并合成双链cDNA.经Sephrose CL-2B凝胶过滤柱层析后,收集大于400 bp以上的双链cDNA片段,将其连接到pTRG载体上,转化到XL1-Blue MRF′Kan感受态细胞后构建成红莲水稻幼穗细菌双杂交文库.经检测计算该原始文库容量为1.03×106pfu/mL,对随机挑取的100个克隆进行PCR鉴定显示重组率接近100%而且大于800 bp的插入片段达到97%.扩增后文库的容量达到1.05×1010pfu/mL.

嗜热自养甲烷杆菌的抗逆分子机制

为揭示嗜热厌氧古菌适应极端环境的分子机理,分别在不同温度(50℃,60℃,65℃和70℃)培养嗜热自养甲烷杆菌,利用Real-time RT-PCR研究其二硫键异构酶(mtPDI)mRNA的表达情况.结果显示,mtPDI mRNA在上述情况下都有表达,但当温度偏离菌体最适生长温度(65℃),表达量会提高,在50℃和70℃时达到最大.mtPDI mRNA的表达量在50℃下培养时是最适生长温度(65℃)时的10.3倍,在60℃培养时是最适生长温度(65℃)时的2.7倍,在70℃培养时是最适生长温度(65℃)时的9.3倍.说明mtPDI的表达与温度相关,当偏离最适生长温度时mtPDI mRNA表达上调,以帮助体内蛋白质正确折叠.研究表明mtPDI具有协助嗜热自养甲烷杆菌抵抗外界逆境胁迫的作用.

豆科凝集素基因Le4的克隆及其表达产物对蚜虫的抗性

植物凝集素是含有一个或者多个非催化结构,并能可逆结合特异单糖或寡糖的蛋白,它具有凝集细胞、沉淀多糖和糖蛋白的功能。近年来,植物凝集素因其独特的生理功能,在农作物抗虫工程中获得了广泛的关注。本研究采用RT-PCR的方法,从浙江苞萝黄大豆叶片中成功克隆了一个新的豆科凝集素Le4基因,利用p ET-28a质粒构建了Le4基因的原核表达载体,成功表达了Le4蛋白。通过对诱导温度及异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)终浓度等条件进行优化,利用Western blotting技术,在Le4表达菌株超声破碎后的上清液中检测到了可溶性的Le4蛋白。通过涂抹法将含有可溶性Le4表达蛋白的大肠杆菌菌液涂抹在小麦叶片上,与涂抹空载体菌液相比,小麦叶片麦长管蚜数目减少了约50%。以上结果初步表明来源于大豆的凝集素基因Le4蛋白具有杀虫效应。

粳稻95122A和95122B悬浮系建立及抗氧化性分析

细胞质雄性不育是杂种优势利用的基石,揭示其发生机理将有助于水稻杂种优势的利用。本研究选取已有配组品种的包台型粳稻细胞质雄性不育系95122A及其保持系95122B为材料,基于MS(N6)培养基主成分建立了其状态良好的悬浮细胞系,发现95122B悬浮细胞活力和生长势在各个生长阶段均比95122A的强,两种悬浮细胞从第3~6天进入指数生长期。用不同浓度的H2O2处理第4天活力较强的两种悬浮细胞,对其4种抗氧化酶即过氧化物酶(peroxidase,POD)、过氧化氢酶(catalase,CAT)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和抗坏血酸过氧化物酶(ascorbate peroxidase,APX)活性进行检测时发现,两种悬浮细胞中的4种酶活性均是低H2O2浓度时先略有升高,随后降低,但升高和降低的程度及对应的H2O2浓度依酶的种类不同有所差异,而在相同的情况下,95122B悬浮细胞比95122A悬浮细胞具有较高的抗氧化酶活性,显示95122B具有较95122A强的H2O2抗性。初步确定了适于95122A和95122B悬浮细胞逆境处理的H2O2浓度为10~20 mmol/L。为进一步研究粳稻95122A不育发生的分子遗传机理奠定基础,也为粳型细胞质雄性不育系应用于生产实践提供有力的理论依据。

水稻窄叶突变体相关基因的研究进展

片是作物光合作用与呼吸作用的重要场所,同时也作为蒸腾作用的主要调节器官。其形态构成与转录因子、激素以及小RNA相关并受其调控,深入探究叶片发育的网络调控机理对高光效育种工作具有非常重要的意义。窄叶性状是叶形态的一种,在超高产株型育种中偏向选择窄叶,窄叶是株型构成非常重要方面,而株型与作物产量又密不可分,因此水稻窄叶作为一种叶型农艺性状,在株型育种中具有非常重要的应用价值。本研究归纳总结了至今为止已定位克隆的水稻窄叶突变体相关基因及其调控机理,并进一步探讨窄叶突变体基因的一因多效型,分析其在育种中的应用,以期为水稻株型育种中叶型性状的选择提供理论依据。

基于CRISPR/Cas9技术创建OssHSP家族基因突变体

分子伴侣是在生物大分子的折叠、组装、转运及降解等过程中起协助作用,但自身并不发生任何变化的一大类广泛存在于生物体内的蛋白质分子。小热激蛋白(small heat shock protein,sHSP)是一类在抵抗逆境胁迫过程中扮演重要角色的蛋白质分子。本研究在OssHSP基因外显子区域设计了带有PAM序列的靶位点,利用PCR扩增获得OssHSP基因sgRNA表达盒,成功构建了CRISPR/Cas9敲除载体;利用根癌农杆菌介导的遗传转化获得2个OssHSP基因(Os01g0136100和Os02g0782500)的T0代CRISPR转基因植株;通过PCR扩增和测序确定突变类型,获得48株不同突变类型的OssHSP1突变单株,6株不同突变类型的OssHSP2突变单株,6株不同突变类型的OssHSP1和OssHSP2双突变单株,为进一步开展OssHSP基因功能的研究提供了材料。