口蹄疫、猪瘟和高致病性猪蓝耳病三种疫苗同步两点免疫新技术研究与应用

本研究采用猪口蹄疫（FMD）灭活疫苗和合成肽疫苗、猪瘟（CSF）脾淋活疫苗和高致病性猪蓝耳病（HPPRRS）活疫苗同步两点免疫技术,对被免疫猪只分别进行了小组试验、免疫持续期观察等试验研究,并用ELISA方法定期对各阶段血清抗体进行检测,旨在探索一种适合基层应用的FMD、CSF、HPPRRS三种疫苗同步分点注射免疫技术,提高免疫密度和免疫效果,降低基层防疫人员劳动强度,提高工作效率,破解基层强制免疫工作难题。本研究得出下列结论：（1）建立了口蹄疫、猪瘟和高致病性猪蓝耳病三种疫苗同步两点免疫技术方法并证明了其临床应用的可行性与科学性。（2）口蹄疫、猪瘟和高致病性猪蓝耳病三种疫苗同步两点免疫证明了三种疫苗同步分点免疫相互间未出现免疫干扰现象。同时,对应用三种疫苗同步两点免疫技术中各病种免疫效果的同步评估需在免疫后35-40d期间进行监测为佳。（3）三种疫苗同步两点免疫技术列入云南省2013年重大动物疫病免疫方案,在全省范围内推广应用至今。本研究证明了三种疫苗同步分点注射的可行性和科学性,并将三种疫苗同步两点免疫技术大面积应用于免疫工作,解决了困扰基层临床免疫的难点问题,为其临床应用提供了科学依据和数据支持,在生产实际的临床应用中具有重要意义。

口蹄疫兔化弱毒疫苗ZBatt株与其亲本强毒株生物学特性的比较研究

为研究口蹄疫兔化弱毒疫苗ZBatt株和其亲本强毒株ZBCF222之间的生物学特性差异,测定了ZBatt和ZBCF222病毒复制效率,病毒感染细胞后6种宿主因子mRNA表达水平,比较了病毒对乳鼠和豚鼠致病性差异。结果显示:ZBatt和ZBCF222分别感染PK、IBRS-2细胞均不产生明显CPE,感染BHK-21细胞均可以产生CPE和相似的蚀斑形态,病毒生长曲线无显著差异(P>0.05);ZBCF222感染牛原代肾细胞(BK)可产生CPE,形成明显蚀斑,接种豚鼠可产生致病性,而ZBatt感染BK细胞不产生CPE,对豚鼠无明显致病性;二者在BK细胞上的病毒生长曲线和RNA复制效率呈显著性差异(P<0.05);ZBCF222感染BK细胞后宿主因子表达水平与ZBatt感染差异均不显著(P>0.05)。本研究结果表明,亲本强毒株ZBCF222对天然宿主来源细胞具有强致病力,弱毒疫苗ZBatt则不具有致病力,豚鼠可作为试验动物替代牛用于ZB病毒毒力差异评价。

口蹄疫灭活疫苗免疫增强剂的可行性应用分析

为评价免疫增强剂对口蹄疫(FMD)灭活疫苗的免疫增强作用,本研究采用A1人参茎叶总皂苷、A2皂苷、A3左旋咪唑和A4牛巴氏杆菌4种免疫增强剂配制了11001、11002、11003、11004 4批次的FMD O型Asia-1型二价灭活疫苗(OS/99株+JSL/06株),以常规11005批商品苗为对照分别免疫动物,在攻毒的同时,采血进行淋巴细胞增殖检测、免疫血清检测、本动物保护试验评价疫苗效果。结果显示,11002和11004批疫苗安全合格,淋巴细胞增殖效果明显,免疫血清抗体水平比常规疫苗有显著提高(p<0.05),抗体阳转率、中和抗体高于常规灭活疫苗,本动物攻毒保护试验效果明显。结果表明,A2皂苷和A4牛巴氏杆菌两种免疫增强剂能够提高FMD灭活疫苗免疫效果。

BHK-21悬浮细胞培养条件筛选及口蹄疫病毒悬浮培养工艺研究

为了实现在幼地鼠肾细胞(BHK-21细胞)低血清全悬浮培养工艺下获得更高含量的口蹄疫病毒(FMDV),试验对比了4株不同来源的BHK-21悬浮细胞的培养特性,按体积1%、2%和5%分别接种O型、A型FMDV,接种后4,8,12,16,20,24小时取样进行146S、半数致死量(LD)对比研究,筛选形态良好、培养特性更稳定的BHK-21悬浮细胞株;以摇瓶悬浮培养筛选得到的BHK-21悬浮细胞株,使用O型FMDV O/HB/HK/99株、A型FMDV AF/72株,从接种剂量、活细胞密度(VCD)、病毒培养温度、病毒培养pH值、换液体积比例等工艺参数对病毒146S表达的影响进行了研究,并在7.5,50,500 L生物反应器中逐级放大,进行了O型FMDV O/HB/HK/99株、A型FMDV AF/72株各3个批次病毒液悬浮培养研究,确定O型FMDV O/HB/HK/99株、A型FMDV AF/72株接种BHK-21悬浮细胞的培养工艺。结果表明:筛选得到1株形态良好、培养特性更稳定的BHK-21-CP005悬浮细胞株;O型FMDV O/HB/HK/99株、A型FMDV AF/72株在摇瓶低血清悬浮培养的BHK-21-CP005悬浮细胞株中增殖的最适条件为,当细胞培养48 h, VCD达4.5×10~6/mL,按体积2%接种O/HB/HK/99株和AF/72株,培养温度为36.5~37.0℃,pH值为7.30~7.50,按4∶5体积比例换液,接种病毒16~20 h后收获病毒液,病毒146S含量不低于9.0μg/mL,LD不低于1×10/0.2 mL。说明使用BHK-21-CP005株低血清全悬浮培养生产更高含量的FMDV工艺稳定,可以实现规模化生产。

ELISA抗体水平评价口蹄疫灭活疫苗免疫效果的可行性分析

为了探讨免疫抗体评价口蹄疫灭活疫苗效果的可行性,分别用5批次的口蹄疫O型-亚洲1型二价灭活疫苗(OS/99株+JSL/06株)、5批次的猪口蹄疫O型灭活疫苗(OZK/93株+OS/99株)免疫动物,在攻毒的同时采血分离血清,用液相阻断ELISA测定抗体效价,以分析抗体效价与免疫保护的关系。统计学分析表明,二价灭活疫苗的O型免疫抗体值与攻毒保护率(概率单位)之间呈正相关关系(P<0.01),相关系数为0.986;亚洲1型免疫抗体值与攻毒保护率(概率单位)之间呈正相关关系(P<0.05),相关系数为0.997,猪口蹄疫O型灭活疫苗免疫抗体值与攻毒保护率(概率单位)之间不呈正相关关系(P>0.05)。结果表明,应用抗体水平评价二价灭活疫苗的免疫效果是完全可行的,但用其评价猪O型灭活疫苗的免疫效果不具有可行性。