尘螨主要变应原Der f1融合基因真核表达载体的构建

目的:构建尘螨主要变应原Derf1融合基因真核表达载体,为进一步转染真核细胞表达融合蛋白奠定基础。方法:根据Genebank中Derf1基因的核酸序列(AB034946),设计引物,采用PCR法,从保存的JM109工程菌中扩增Derf1编码基因,将其连接到小鼠IL-12(mIL-12)基因3′端,组成融合基因mIL-12/Derf1,再克隆到真核表达质粒pcDNA3.1/myc-hisA上。结果:经测序、比对,内切酶酶切,证实融合基因片段成功连接并亚克隆到真核表达质粒pcDNA3.1/myc-hisA。结论:成功构建了尘螨变应原Derf1和小鼠IL-12融合基因的真核表达载体,为尘螨变应原Derf1融合蛋白的表达奠定了基础。

尘螨变应原Der f1植物表达载体的构建及表达

目的:构建尘螨变应原Der f1植物表达载体并侵染烟草叶片表达。方法:从保存的含pET28a(+)-Der f1的甘油菌株中扩增Der f1基因,并克隆到质粒载体中,提取质粒,进行测序;以ClaⅠ、SalⅠ双酶切,将Der f1基因克隆到马铃薯X病毒(PVX)载体中,构建植物病毒表达载体;将PVX-Der f1转化脓杆菌,挑取Kan、Tet抗性阳性的菌株侵染烟草叶片进行蛋白表达,采用SDS-PAGE和Western blot对表达蛋白进行鉴定和分析。结果:经SDS-PAGE分析,有4株烟草叶片蛋白提取物在34Mr处有特异性蛋白条带;经Western blot进一步验证其变应原,结果显示,烟草叶片中获得的重组蛋白在34Mr处与阳性血清发生特异性结合,而与阴性血清并不发生结合。结论:成功构建了植物病毒表达载体PVX-Der f1并获得表达,为尘螨变应原Der f1的研究提供新思路。

HBsAg空间结构与分子进化分析

目的:获得乙型肝炎表面抗原HBsAg的生物信息学资料。方法:从Genbank中获得HBsAg的核酸序列,用ExPaSy、EBI和NCBI网站的在线软件推导其编码氨基酸序列、理化性质、空间结构,并在Blastn比对后选择不同地理株进行分子进化进行分析。结果:HBsAg由226个氨基酸组成,分子量25777．6Da,等电点8．74,为亲水性蛋白质;信号肽位于1-29aa处,二级结构由-螺旋(18．14%)、延伸(25．66%)、随机线圈(56．19%)组成。中国与日本、冈比亚、德国、西班牙、墨西哥、荷兰、瑞典、泰国的HBsAg相似率依次为99%、94%、94%、94%、91%、89%、98%、98%、98%．。用不同地理株HBsAg核酸序列构建出的分子进化树中,中国和日本的聚成一簇。结论:通过对HBsAg的生物信息学分析获得该抗原特征,为进一步研究乙型肝炎的感染与发病机制、研制基因工程疫苗以及研究HBsAg新的功能域等提供依据。

乙型病毒性肝炎动物模型/细胞模型研究进展

乙型病毒性肝炎是一种在世界范围内严重危害人类健康的传染病,其病原体乙型病毒性肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)是目前所知的最小的嗜肝病毒,其DNA为部分双链环状,约3.2kb.

乙肝病人T细胞亚群、mIL-2R的变化及意义

目的检测乙型病毒性肝炎病人外周血T细胞亚群和膜白介素-2受体(mIL—2R)表达水平并探讨其在乙肝发病机制中的作用。方法采用生物素-链霉亲和素法对188例乙肝病人外周血单个核细胞(PBMC)进行T细胞亚群及植物血凝素(PHA)诱导前后mIL—2R水平测定。结果乙肝病人T淋巴细胞亚群中CD3^+、CD4^+降低,CD8^+升高,CD4^+/CD8^+比值降低,外周血单个核细胞mIL—2R表达水平在PHA诱导前后均降低,与正常对照相比,差异有显著意义(P<0.01);另外,乙肝病人PBMC中HBV—DNA(+)病人与PBMC内HBV—DNA(-)病人相比,mIL—2R表达水平亦存在较大差异(P<0.01)。结论乙肝病人体内存在明显的细胞免疫功能紊乱,T细胞活化障碍,并与肝病的慢性化相关。

尘螨变应原Der f 2基因克隆及序列分析

目的:获得尘螨变应原Derf2基因及其生物信息学资料.方法:提取粉尘螨总RNA,RT-PCR合成Derf2的cDNA片段,回收PCR产物并连接至pMD19-Tsimple,经测序验证后亚克隆入表达载体pET-28a(+),转化大肠杆菌感受态细胞后提取质粒,双酶切鉴定.用ExPaSy,EBI,NCBI网站的在线软件对测序结果进行分析.结果:RT-PCR扩增获得了Derf2cDNA片段,酶切、电泳结果表明克隆和亚克隆获得成功.与参考序列相比,测序结果多了87bp(77～163),但Blastn发现中国广州和德国Reinbek报道的序列中也含此87bp.同源性、相似性、序列比对及分子进化分析提示,该序列与中国广州和德国Reinbek报道的序列亲缘关系较近.推测该变应原由176个氨基酸组成,与附睾分泌蛋白E1具有同源性,信号肽位于1～17aa处,在6～24aa处有一跨膜螺旋.二级结构由a-螺旋(16.57%),延伸链(32.57%)和随机卷曲(50.86%)组成.结论:获得了粉尘螨变应原Derf2编码基因及其分子特征,为进一步生产基因工程变应原用于临床诊治变态反应性疾病奠定了基础.

尘螨变应原Der f1全序列的原核表达及生物信息学分析

目的 构建尘螨变应原Der fl原核表达体系，并了解其分子特征。方法 提取粉尘螨总RNA，用RT—PCR合成Der fl编码基因，将其克隆至pMD19-T载体，亚克隆至表达载体pET-28a（＋），转化至大肠杆菌并刚IPTG诱导表达。用生物信息学软件对测序结果进行分析并预测其空间结构。结果从粉尘螨总RNA中扩增获得Der fl cDNA片段，成功构建了表达质粒pET-28a（＋）-Der fl，Western blotting显示原核表达获得成功。测序结果提交GenBank，臀陆号为EU095368，该基因长966bp，与参考序列同源性达99．9％，推测其编码氩基酸321个，属疏水蛋白，位于细胞外，信号肽位于1～18氨基酸处。同源性分析提示Der fl和Eur ml相似率为88％，而Der fl和Derpl的相似率为77％，分子进化树中粉尘螨和梅氏嗜霉螨聚成一簇。Derfl的二级结构由α-螺旋（109aa，33．96％）、延伸链（55aa，17．13％）、β-转角（18aa，5．61％）和随机卷曲（139aa，43．30％）组成：结论 尘螨变麻原Der fl原核表达获得成功，为进一步生产重组变麻原奠定了基础。生物信息学分析表明粉尘螨和梅氏嗜霉螨的亲缘关系可能更近，而与屋尘螨关系稍远，此与现行的形态学分类系统并不符合。

108例支气管哮喘患者MMP-9和TIMP-1血清水平变化及相关性分析

目的探讨支气管哮喘(哮喘)患者MMP-9和TIMP-1血清水平变化及其相关关系。方法采用酶联免疫吸附测定(ELISA)检测52例急性哮喘患者(急性组)、56例慢性哮喘患者(慢性组)和来自同期海南医学院附属医院健康体检中心的60名健康对照者(对照组)的MMP-9和TIMP-1血清水平,并对结果进行相关分析。结果急性组、慢性组与对照组比较,MMP-9和TIMP-1血清水平明显增高(P<0.05)。MMP-9与TIMP-1血清水平存在明显的相关关系(r=0.632,P<0.05)。结论 MMP-9与TIMP-1关系密切,并且参与了气道重塑的过程,其血清水平对哮喘的病情评估具有指导意义。

3种常见尘螨分子进化关系的初步探讨

为探讨粉尘螨(Dermatophagoides farinae)、屋尘螨(Dermatophagoides pteronyssinus)和梅氏嗜霉螨(Euroglyphus maynei)的分类,采用PCR扩增获得粉尘螨1类(Derf1)和2类变应原(Derf2)的cDNA片段,经测序后推导氨基酸序列,与GenBank中的屋尘螨Derp1、Derp2和梅氏嗜霉螨Eurm1、Eurm2氨基酸序列进行比对,分别构建1类和2类变应原分子进化树。结果显示变应原之间相似度,Derp1与Eurm1为86%,Derp1与Derf1为83%;Derp2与Eurm2为87%,Derp2与Derf2为67%。用变应原氨基酸序列构建分子进化树,1类变应原Derp1与Eurm1聚成一簇,2类变应原Derp2与Eurm2聚成一簇。结果表明屋尘螨和梅氏嗜霉螨亲缘关系较近,而与粉尘螨较远。

多媒体技术在人体寄生虫学实验教学中的效果

应用多媒体技术对2004级本科生开展人体寄生虫实验教学,问卷调查教学效果,并现场考核学生实验技能。2003级学生为对照组,比较两组学生实验成绩。结果实验组和对照组实验成绩分别为(88.76±8.45)和(82.38±12.32),差异有显著性(P<0.01)。实验组学生对多媒体教学效果满意度及其技能考核优秀率较高。多媒体技术有助于提高寄生虫学实验教学效果。

哮喘患者Th细胞与MMPs血清水平相关性分析

目的:探讨哮喘患者Th1、Th2细胞与MMP-2和MMP-9血清水平的相关关系。方法:采用流式细胞术检测52例急性发作期患者和56例慢性持续期患者Th1和Th2细胞水平,同时用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测MMP-2和MMP-9的血清水平,对检测结果进行相关性分析。结果:两组患者Th1和Th2细胞与MMP-9的血清水平均存在负相关关系(P<0.05),而Th1和Th2细胞与MMP-2血清水平均不具有相关关系(P>0.05)。结论:哮喘患者中Th细胞与MMPs血清水平关系密切,Th细胞通过分泌细胞因子调节MMPs的血清水平,影响气道重塑的发生过程。

医学微生物学双语教学的尝试与思考

为了探索适合于医学院校医学的双语教学模式,笔者结合医学微生物学的课程特点,总结了近年来医学微生物学双语教学实践活动,分析了进行双语教学的可行性,同时,针对目前双语教学中存在的问题,如师资、教材、教学模式和手段等方面,提出了具体的对策.

RhoA在卵巢癌组织中的表达及意义

目的探讨RhoA在卵巢癌组织中的表达及其临床意义。方法用免疫组织化学S-P法检测63例卵巢癌患者、17例卵巢良性肿瘤患者和9例正常对照者卵巢组织中RhoA蛋白的表达。结果卵巢癌患者中RhoA阳性率为76.2%,其中强阳性11例(17.5%),明显高于正常对照组和卵巢良性肿瘤组(P<0.01);高分化、中分化和低分化卵巢癌患者RhoA阳性率依次为76.9%、77.8%和66.7%,差异无统计学意义(P>0.05);Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期和Ⅳ期卵巢癌患者RhoA阳性率依次为69.0%、76.5%、83.3%和100.0%,差异有统计学意义(P<0.05)。结论卵巢癌患者RhoA表达水平高于正常人,其可能参与卵巢癌的发生发展,可作为卵巢癌的临床诊断及预后评估提供有价值的参考。

屋尘螨变应原Der p 1基因的克隆和原核表达

目的克隆和分析屋尘螨主要变应原Der p 1,并实现原核表达。方法分离屋尘螨总RNA,根据Gen Bank已公布的Der p 1核酸序列设计引物,用RT-PCR扩增Der p 1编码基因,克隆至pMD19-T载体、亚克隆至表达载体pET-28a(+),将表达质粒转化至E.coliBL21(DE3)并用IPTG诱导表达,并对表达产物进行免疫印迹鉴定。结果成功构建了表达质粒pET-28a(+)-Der f 1,Western blotting显示原核表达获得成功。序列分析表明所获得的Der p 1编码基因与参考序列同源性达99.9%,推测其编码氨基酸222个。屋尘螨和粉尘螨1类变应原氨基酸序列相似率为60%,而粉尘螨与梅氏嗜霉螨1类变应原相似率为85%,分子进化分析亦提示粉尘螨和梅氏嗜霉螨亲缘关系较近。推测所获rDer p 1二级结构中,α螺旋占33.78%,延伸链占21.62%,随机线圈占44.59%。结论尘螨变应原Der p 1原核表达获得成功,为进一步生产重组变应原奠定了基础。序列分析表明粉尘螨和梅氏嗜霉螨的亲缘关系可能更近,而与屋尘螨关系稍远,此与现行的形态学分类系统并不符合。

一株具有免疫增强活性的海南红树林真菌WC1016的分类鉴定

目的:对从海南文昌清澜港红树林土壤样本中分离到的一株具有免疫增强活性的真菌菌株WC1016进行分类鉴定。方法:通过菌落特征、显微形态、ITS序列测定及其系统发育分析对菌株WC1016进行鉴定。结果:菌株WC1016在CA上形成典型紫色绒絮状菌落。显微观察其分生孢子梗具有拟青霉属的典型特征。ITS序列测定及系统发育分析表明菌株WC1016与淡紫拟青霉(Paecilo-myces lilacinus)菌株XLA同源性最高。结论:通过形态学观察和分子生物学分析鉴定菌株WC1016为淡紫拟青霉。首次鉴定发现一株具有免疫增强活性的淡紫拟青霉。

粉尘螨变应原第6组分全长cDNA克隆及生物信息学分析

目的:获得粉尘螨变应原第6组分编码基因并了解其分子特征。方法:根据GeneBank已公布的Derf6核酸序列设计引物,用RT-PCR扩增获得其编码基因,插入pMD19-T载体进行序列测定和生物信息学分析。结果:获得的Der f6 cD-NA全长为840 bp,与参考序列同源性达96.8%,含1个完整的开放读码框。推测编码蛋白由279个氨基酸组成,信号肽序列位于1～19 aa,亲水性指数为-0.139,跨膜区域位于1～19 aa,二级结构由α-螺旋(7.17%)、延伸主链(36.56%)和无规卷曲(56.27%)组成;亚细胞定位于细胞外,N-端第6位和第11位的亮氨酸有明显的序列核输出信号;可能为糜蛋白酶,具有cAMP和cGMP依赖的蛋白激酶磷酸化位点、蛋白激酶C磷酸化位点、酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点、N端酰基化位点等。结论:获得了Derf6基因全长,其编码的细胞外疏水性蛋白可能具有糜蛋白酶活性。

尘螨变应原Der f1核酸序列测定及其分子进化分析

目的:对尘螨主要变应原Der f1进行核酸序列测定,探讨其系统进化信息。方法:根据Genbank公布的Der f1基因序列设计引物,巢式PCR扩增Der f1的cDNA,纯化、回收、克隆至pMD19-T simple后进行序列测定,序列比对后用Clustal W 1.83构建分子进化树。结果:成功扩增出Der f1的cDNA片段,测序表明该基因含ORF1个,长度966bp,与参考序列同源性达99.9%。该变应原具半胱氨酸蛋白酶活性,与果蝇进化关系最远,与梅氏嗜霉螨进化关系最近。结论:成功获得了尘螨变应原Der f1基因片段,根据其编码的氨基酸序列构建出的系统进化树与形态学分类不一致。

HCVCE2融合蛋白在家蚕培养细胞、蚕幼虫中的表达及其初步应用

目的:高效表达HCVCE2融合蛋白并进行初步应用.方法:将2a型HCV全长CE2基因的cDNA重组于质粒pBacPAK8,构建重组转移载体pBacPAK CE2,与经线性化修饰的家蚕核型多角体病毒(BmNPV)DNA共转染家蚕培养细胞株,构建重组病毒.双酶切及PCR鉴定重组病毒基因组中目的片段的表达.重组病毒感染BmN细胞株及五龄家蚕幼虫后,SDS PAGE分析细胞培养上清、细胞抽提物及幼虫体液样品中,HCVCE2融合蛋白的特异性条带.并用间接ELISA法初步检测表达产物的生物活性.结果:双酶切及PCR鉴定重组病毒基因组含有约1.6kb的目的片段,重组病毒感染后的BmN细胞培养上清、细胞抽提物及幼虫体液样品中,均可见一Mr约90×103的特异性条带;用间接ELISA检测证明表达产物具有较好的免疫原性.结论:HCVCE2融合基因在家蚕培养细胞及蚕幼虫中获得了高效表达,并具有生物活性,为进一步进行疫苗的研究及临床诊断试剂的开发奠定基础.

尘螨变应原Der p 2基因克隆及原核表达

目的原核表达尘螨主要变应原Der p 2。方法分离屋尘螨总RNA,根据GenBank已公布的Der p 2核酸序列设计引物用RT-PCR扩增Der p 2编码基因,克隆至pMD19-T载体、亚克隆至表达载体pET28a(+),将表达质粒转化至Escherichia coli BL21(DE3)并用IPTG诱导表达,并对表达产物进行免疫印迹鉴定。结果成功构建了表达质粒pET28a(+)-Derp2,SDS-PAGE和Western blotting显示原核表达获得成功。序列分析表明所获得的Der p 2编码基因与参考序列同源性达99.54%,推测其编码氨基酸130个,相对分子质量约为14348.5。结论尘螨变应原Der p 2原核表达获得成功,为进一步生产重组变应原奠定了基础。