适合转基因绿色荧光茧丝护色脱胶的酶类及脱胶工艺条件

转基因绿色荧光茧中的绿色荧光蛋白存在于丝素中,采用传统的皂碱脱胶法极易使茧丝中的绿色荧光蛋白失活。分别用木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶对转基因绿色荧光茧丝进行护色脱胶,并通过正交试验优化脱胶工艺条件。观察茧丝经不同酶类脱胶后的绿色荧光强度,筛选出适合转基因绿色荧光茧丝酶法脱胶的酶种类为碱性蛋白酶,其最适脱胶工艺条件为:浴比1∶50,酶用量3 g/L,反应温度50℃,反应时间120 min,p H 9.0。在此优化工艺条件下用碱性蛋白酶对转基因绿色荧光茧丝进行脱胶的脱胶率可达25.16%,茧丝呈现明显的绿色荧光,而且茧丝表面光滑平整,机械性能损失较小,可以较好地保持茧丝的绿色荧光特性和力学性能。

家蚕丝素P25蛋白的多克隆抗体制备与应用

P25蛋白是家蚕(Bombyx mori)丝素蛋白的主要成分之一。根据BmP 25基因ORF序列设计引物,以家蚕5龄第3天丝腺cD NA为模板,RT-PCR扩增获得BmP 25的ORF全长片段。将构建的含BmP 25的原核表达重组质粒转化大肠埃希菌Rosetta(DE3)菌株感受态细胞,对家蚕丝素P25蛋白进行重组表达和纯化,并免疫家兔制备获得多克隆抗体,用于研究家蚕丝腺中P25蛋白的合成和分泌规律。利用制备的多克隆抗体对家蚕品种大造5龄第3天幼虫9个组织的总蛋白质样品进行Western blot检测,结果在中部丝腺和后部丝腺检测到P25蛋白,表明该抗体有较好的特异性。进一步利用此多克隆抗体分别对家蚕5龄第5天幼虫中部丝腺和后部丝腺不同区域进行荧光免疫组化分析,结果在后部丝腺的细胞和腔内观察到明显的荧光信号,而中部丝腺后部的细胞仅有微弱信号,腔内的荧光信号强度随着丝素蛋白的从后向前运输越来越弱,以致在中部丝腺的前部和中部未检测到荧光信号。推测可能是P25蛋白在丝素蛋白从溶胶状态到凝胶状态的转化过程中,被逐步包裹在丝素蛋白聚合物中导致其不能被检测到。利用该多克隆抗体对家蚕不同品种的茧丝蛋白进行Western blot检测,均能获得特异性的杂交条带,表明该抗体还可用于家蚕茧丝及丝制品的分子检测鉴定,为开发丝制品的检测试剂盒提供了条件。