梅山猪β干扰素基因的克隆、原核表达及生物活性

利用 PCR技术从中国梅山猪白细胞总 DNA中扩增出猪β干扰素基因 (MS- IFNβ)。将 PCR产物克隆至 p MD18-T载体 ,利用双脱氧末端终止法测定了全基因的核苷酸序列。序列分析表明 ,β干扰素基因全长 5 6 1bp,编码 186个氨基酸 ,与 Gen Bank中 S4 1178的序列同源性达 99% ,在 12 8、177位核苷酸处发生了点变异 ,由 G变为 A,T变为 C,但仅导致 4 3位氨基酸由 G变为 E。在此基础上 ,合成了 1对引物 ,通过 PCR方法将编码成熟蛋白基因亚克隆到 p GEX-KG表达载体 ,转化宿主菌 BL2 1 (DE3) ,经 IPTG诱导后 ,得到高效表达 ,所表达蛋白质的大小约为 4 70 0 0 ,占总蛋白的2 3%。表达产物主要为不溶性的包涵体 ,包涵体经提纯后 ,能够抑制口蹄疫病毒 (FMDV)

口蹄疫诊断技术研究进展

口蹄疫的有效控制关键在于早期检测 ,然而有很多疾病症状与口蹄疫相似 ,仅靠临床症状难以确诊 ,因此必须进行实验室诊断。实验室诊断包括病毒学诊断和血清学诊断。病毒学诊断方法有病毒分离、补体结合试验、酶联免疫吸附试验 ( EL ISA)、RT-PCR以及乳胶凝集试验 ( L AT)。 RT-PCR有待进一步完善 ,而用于野外检测的现场诊断方法已取得可喜进展。血清学诊断包括中和试验和 EL ISA,中和试验已经被 EL ISA方法取代 ,并且通过检测非结构蛋白的抗体可以区分感染动物和免疫动物。更加快速、敏感、可靠以及用于检测潜伏感染的诊断技术将是今后研究的热点。

口蹄疫病毒VP1基因C末端串连表达及其抗体ELISA方法的初步建立

口蹄疫病毒主要免疫原性基因VP1的B细胞和T细胞抗原表位位于其C末端,参照Taiwanse97(AJ294928)设计了1对特异性引物,扩增出VP1基因C末端。序列分析表明:其C末端长285bp,编码74个氨基酸,与O/HKN/12/91、O/PEN/TAW/99核苷酸和氨基酸同源性分别为95%、93%和96%、93%;利用同尾酶Xho 、Sal 将VP1基因C末端串连起来;再将单拷贝和双拷贝C末端基因插入到原核表达载体pGEX-KG后,转化BL21(DE3),在IPTG诱导下获得表达,经Westernblot检测证实表达产物具有活性。以表达产物包被ELISA板,初步建立了特异、敏感的ELISA诊断方法。同时用表达产物免疫Balb/c小鼠,能产生一定的抗O型口蹄疫病毒的抗体。

仔猪致病性大肠杆菌分离鉴定及药敏试验

从20多个猪场中采集仔猪腹泻粪便,进行大肠杆菌的分离培养,经接种小白鼠进行致病性鉴定后,共获得276株致病性大肠杆菌;并从水肿病猪的水肿液中分离鉴定出1株猪水肿病致病性大肠杆菌。对其中112株进行了药敏试验;先锋霉素Ⅴ的敏感菌株为96.3％,环丙沙星为56.3％,诺氟沙星为50.5％,卡那霉素和庆大霉素均为45.9％。菌株的耐药率,四环素为96.8％,链霉素为71.8％,复方新诺明为67.5％,随机抽取10株进行了5种微量糖发酵试验;结果均符合大肠杆菌生化特性。此外对广西某猪场分离出的大肠杆菌进行了黏附素抗原鉴定为阴性。

规模化猪场大肠杆菌的耐药性监测及血清流行病学调查

为了调查猪致病性大肠杆菌的耐药性及流行血清型 ,从湖北、河南、江西、安徽、浙江等省的 33个猪场采集 32 1份仔猪黄、白痢病料进行细菌的分离和生化鉴定 ,结果分离到大肠杆菌 30 2株 ,其中致病性大肠杆菌 2 76株。对 112株致病性大肠杆菌进行了 15种抗生素敏感性试验 ,发现分离菌株对 15种药物均有不同程度的耐药性 :青霉素 G对其完全没有抑制作用 ;先锋霉素 抑制作用最强 (97.3% ) ,其次为呋喃妥因 (78.6 % )、痢特灵 (71.4 % )、环丙沙星(6 8.8% )、诺氟沙星 (6 5 .1% )。 112株菌中 ,有 4 7种耐药谱型 ,多数为 6耐以上的菌株 (80株 ) ,占供试菌株的 71.4 %。应用微量平板凝集试验 ,对分离的 2 76株致病菌进行了血清型鉴定 ,鉴定共有 72种血清型 ,其中优势血清型 10种 ,占能定型分离致病菌株的 5 3.7%。

鸡α干扰素基因的克隆、原核表达及抗病毒效果研究

通过PCR从三黄肉鸡的肝脏基因组中扩增了鸡α干扰素(ChIFN-α)全长基因。序列分析表明ChIFN-α基因全长582bp,亚克隆其成熟蛋白编码基因(489bp),利用基因重组技术构建了E.coli/pET-28a(+)-IFNα,使IFN-α置于pET-28a的T7启动子下游并同6×His(多聚组氨酸标签)-Tag融合。经酶切鉴定,DNA测序证实重组质粒构建正确;将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,SDS-PAGE,Western-blot分析证实表达出22kD左右的融合蛋白,表达的蛋白以不溶性的包涵体形式存在并且具有良好的免疫学活性。提纯的包涵体纯度可达70%以上,用镍亲和层析方法纯化蛋白则可达到95%。经透析复性后的蛋白在鸡胚成纤维细胞上能够抑制H9N2禽流感病毒的复制。鸡胚试验中重组干扰素抗病毒效果好在H9N2禽流感病毒攻毒组中,能保护鸡胚并使其孵出率达到100%的重组干扰素最小蛋白含量为2μg;重组干扰素对新城疫病毒复制也有一定的抑制能力,延迟该病毒复制时间为12h至48h;雏鸡试验表明重组干扰素也能较好地抵抗H9N2禽流感病毒对雏鸡的感染。两组试验均表明,亲和层析纯化蛋白是包涵体蛋白活性的20倍左右。

咪唑安定联合依托咪酯对腹腔镜胆囊切除术后肝功能、MDA及SOD水平影响研究

目的探讨咪唑安定联合依托咪酯对腹腔镜胆囊切除术后肝功能、丙二醛(malondialdehyde,MDA)及超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)水平的影响。方法收集行腹腔镜胆囊切除术的患者80例,随机分为对照组和实验组,每组各40例,分别于术前给予相应的麻醉诱导药物,手术后,对所有患者的血清MDA、SOD、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)及肝功能情况进行检测。结果手术后,与对照组比较,实验组患者血清丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase,ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase,AST)、总胆红素(total bilirubin,TBIL)水平较低(P<0.05);实验组患者的血清MDA水平较低(P<0.05);实验组患者的SOD、GSH-PX水平较高(P<0.05)。结论咪唑安定联合依托咪酯能够减轻腹腔镜胆囊切除术后患者的氧化应激反应,有利于肝功能的恢复。

“两家”融合“四循环”一体培养牧医领军人才的实践

在当前国家战略和行业发展迫切需求高层次创新型人才的背景下,研究生培养模式的改革亟待进行。华中农业大学针对牧医行业产教融合之困和领军人才培养之难,形成“科学家+企业家”的“两家”融合育人理念,构建“产业‒产业”问题循环、“科研创新平台‒行业龙头企业”平台循环、“论文‒产品‒商品”成果循环、“科研创新者‒行业引领者”身份循环的“四循环”人才培养模式,以期为牧医行业发展提供人才支撑。

猪δ冠状病毒Nsp5的体外表达及其蛋白酶活性分析

猪δ冠状病毒(Porcine deltacoronavirus,PDCo V)是一种新发现的肠道冠状病毒,可引起仔猪的腹泻。冠状病毒编码的非结构蛋白Nsp5是一种3C样蛋白酶,在病毒多聚前体蛋白加工以及免疫调节中发挥重要作用。本研究以PDCo V CHN-HN-2014株为模板,通过RT-PCR扩增Nsp5基因并将其克隆到原核表达载体p ET-28a(+)中,构建了重组表达质粒。将重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导后SDS-PAGE检测,结果表明Nsp5可在大肠杆菌中高效、可溶性表达。采用镍亲和层析对表达的Nsp5蛋白进行纯化,并通过荧光共振能量转移方法检测了其蛋白酶活性,结果表明纯化的Nsp5蛋白能够有效切割含有PDCo V Nsp5氨基端自切割位点的十二肽底物,证实体外表达的Nsp5重组蛋白具有良好的蛋白酶切割活性。猪δ冠状病毒Nsp5蛋白的克隆、表达及其蛋白酶活性检测,为深入研究该蛋白的功能奠定了基础。

猫传染性腹膜炎诊断研究进展

猫传染性腹膜炎(FIP)是由猫传染性腹膜炎病毒(FIPV)引起的全身性、致死性疾病。FIPV属于猫冠状病毒(FCoV),主要感染单核细胞,具有很强的致病性。另一种非致病性冠状病毒,称为猫肠道冠状病毒(FECV),存在于大多数健康猫肠道内。根据血清学和基因序列,可以将FCoV分为Ⅰ型和Ⅱ型,FECV和FIPV在基因组上有一定差异,FECV通常不致死,只引起猫轻微的肠道症状,而FIPV能引起猫的致死性腹膜炎。本文对现有的FIP的诊断方法进行了系统阐述,为FIP的临床和实验室诊断提供参考。

胆囊微创手术患者气道管理的效果

目的:探讨I-gel喉罩于术前经鼻置入胃管对胆囊微创手术患者气道管理效果.方法:将87例行腹腔镜胆囊切除术患者,随机分为3组:Ⅰ组(n=29)经喉罩引流管置入胃管;Ⅱ组(n=29)术前经鼻置入胃管且术中保留,放置I-gel喉罩后不经引流管置入胃管;Ⅲ组(n=29)术前经鼻置入胃管且术中保留,放置I-ge l后经引流管置入胃管.术中记录麻醉与手术时间、苏醒时间、胃管引流情况、喉罩置入与拔除情况,以及术后24 h内不良反应.喉罩置入成功后测定纤维支气管镜检查评分、气道密封压,以及喉罩尖端、罩体腹侧、背侧的pH值.结果:3组置入时间、置入刻度、首次置入成功率、气道密封压、拔除时间、气道峰压、喉罩漏气发生率差异无统计学意义(P>0.05).Ⅰ组(25.3 cmH2O±4.7 cmH2O vs28.1 cmH2O±5.6 cmH2O)、Ⅱ组(24.6 cmH2O±3.8 cmH2O vs 29.2 cmH2O±5.8 cmH2O)、Ⅲ组(24.3 cmH2O±3.1 cmH2O vs 30.4 cmH2O±6.2 cmH2O)的气道峰压均低于气道密封压(P<0.05).3组患者血流动力学平稳,其纤维支气管镜检查评分、不良反应的发生率差异无统计学意义,且术后喉罩尖端、罩体的背侧与腹侧的pH值差异均无统计学意义(P>0.05).结论:胆囊微创手术患者于术前经鼻置入胃管时,I-gel喉罩置入较易,其气道密封性可靠,通气效果良好,气道管理安全有效.

无痛分娩产妇腰硬联合麻醉与硬膜外麻醉对促肾上腺皮质激素皮质醇及C-反应蛋白水平的影响

目的探讨腰硬联合麻醉与硬膜外麻醉在无痛分娩产妇中的麻醉效果及对促肾上腺皮质激素(ACTH)、皮质醇(COR)及C-反应蛋白(CRP)水平的影响。方法选择2018年12月-2019年10月该院收治的无痛分娩产妇151例,根据麻醉方法分为对照组(96例)和观察组(55例)。对照组采用硬膜外麻醉,观察组采用腰硬联合麻醉。分娩后对两组麻醉效果进行评估,比较两组产程、产后出血量、初乳时间、住院时间、Apgar评分、ACTH、COR及CRP水平、分娩方式和麻醉安全性。结果观察组产程、初乳及住院时间均短于对照组(均P<0.05);观察组1 min Apgar评分高于对照组(P<0.05);两组麻醉后ACTH、COR及CRP水平高于麻醉前(P<0.05);观察组麻醉后ACTH、COR及CRP水平低于对照组(P<0.05);观察组与对照组麻醉过程中阴道分娩、剖宫产率、呼吸抑制、低血压、胎儿窘迫及新生儿窒息率发生率比较,差异均无统计学意义(均P>0.05)。结论腰硬联合麻醉用于无痛分娩中能缩短产程,降低产后出血量,亦可降低应激反应与炎症细胞因子水平,能提高自然分娩率,未增加麻醉不良反应发生率,值得推广应用。