兽医专业学位研究生培养过程中的知识融合与实践探索

兽医专业学位研究生的培养目标是培养具有扎实理论基础、丰富实践经验和综合能力的高级专业人才。从兽医专业学位研究生培养存在的问题入手,详细阐述了知识融合与实践探索在兽医专业学位研究生培养中的重要作用,以期为兽医专业学位研究生的培养提供参考。

SVA及α-干扰素对PK-15细胞microRNA转录谱影响的分析

为探究猪塞内卡病毒A(SVA)感染、干扰素(IFN-α)处理对猪肾细胞(PK-15)微RNA(microRNA,miRNA)转录谱的影响,本研究分别构建SVA感染的PK-15(PK-15/SVA)、IFN-α处理的PK-15(PK-15/IFN),SVA感染再经IFN-α处理的PK-15细胞(PK-15/SVA/IFN),通过荧光定量PCR(qPCR)分别检测各组细胞中SVA VP1及IFN-αmRNA的转录水平。结果显示,与PK-15相比,PK-15/SVA及PK-15/SVA/IFN细胞中SVA VP1基因的转录水平极显著升高(P<0.001),PK-15/SVA/IFN中IFN-α的转录水平显著或极显著升高(P<0.05、P<0.01)。通过转录组测序技术(RNA-Seq)分析各组细胞miRNA的转录谱,采用Spss软件统计各组细胞中转录差异miRNA的数量;利用基于负二项分布的DESeq2筛选各组细胞中转录显著差异miRNA;采用miRanda、PITA和RNAhybrid 3个软件预测各组细胞转录显著差异miRNA的靶基因,通过miREvo和mirdeep2软件预测各组细胞中的新miRNA并通过与猪miRNA序列比对得到已知miRNA;分别采用GO功能和KEGG富集分析各组细胞转录显著差异miRNA涉及的生物学功能及信号通路。统计分析结果显示,与PK-15相比,PK-15/IFN、PK-15/SVA和PK-15/SVA/IFN中均存在转录显著差异miRNA,且在SVA感染后细胞中转录的miRNA数量增多,IFN-α刺激则会减少细胞中转录的miRNA数量,SVA感染后再经IFN-α处理则转录的miRNA数量又有所降低。筛选结果显示,与PK-15相比,PK-15/SVA中有167种转录显著差异miRNA,其中94种转录显著上调,73种转录显著下调;与PK-15相比,PK-15/IFN中有98种转录显著差异miRNA,其中55种转录显著上调,43种转录显著下调。预测结果显示,共有290种转录显著差异miRNA有对应靶基因,且共预测到292种新miRNA和345种已知miRNA。选取6种转录显著差异miRNA采用Graphpad prism6.0进行miRNA-mRNA的互作网络展示。结果显示,miR-221-5p的靶基因显著多于其他miRNA,且其靶基因主要与癌症、病毒感染的治疗及宿主的免疫反应有关。GO功能结果显示,在经IFN-α处理或SVA感染后,转录显著差异miRNA的靶基因主要富集于细胞组分和生物过程等功能。KEGG分析结果显示,与PK-15相比,PK-15/SVA和PK-15/IFN细胞中转录显著差异miRNA的靶基因主要富集于Rap1和NF-κB信号通路;与PK-15/IFN相比,PK-15/SVA/IFN细胞中转录显著差异miRNA的靶基因主要富集于PI3K-Akt、NF-κB和肿瘤坏死因子(TNF)等抗病毒免疫相关信号通路;与PK-15/SVA相比,PK-15/SVA/IFN细胞中转录显著差异miRNA的靶基因主要富集于Rap1、NF-κB、TNF和MAPK信号通路。16种转录显著差异miRNA的qPCR结果与RNA-Seq结果一致。综上所述,本研究首次证实IFN-α处理、SVA感染均显著影响PK-15细胞miRNA转录谱,前者促进miRNA的转录,后者则抑制miRNA的转录。其中转录显著差异miRNA的靶基因与宿主抗病毒及肿瘤免疫均等信号通路密切相关,该结果为阐明SVA感染宿主细胞后非编码RNA转录谱变化的分子机制研究奠定基础。

A型塞内卡病毒感染PK-15细胞环状RNA表达谱分析

【目的】分析A型塞内卡病毒(Seneca virus A,SVA)感染猪肾上皮细胞(PK-15)后环状RNA(circular RNA,circRNA)表达谱的变化,探究circRNAs在SVA感染过程中发挥的潜在调控作用。【方法】本研究基于Illumina HiSeq 2000平台对SVA感染及对照PK-15细胞circRNAs转录组进行测序,并对差异表达circRNAs的来源基因进行GO功能及KEGG通路富集分析,通过实时荧光定量PCR对新发现的circRNAs进行表达水平鉴定。【结果】转录组测序结果显示,SVA感染组、PK-15细胞对照组中共有432种circRNAs被发现。在SVA感染PK-15细胞中,87种circRNAs表达水平相对对照组PK-15细胞显著上调,74种circRNAs表达水平显著下调。对差异表达circRNAs的来源基因进行GO功能注释分析表明,SVA感染组差异表达circRNAs来源基因主要富集于核仁、细胞器膜和细胞大分子代谢、发育等生理过程。KEGG通路富集结果显示,SVA感染组差异表达circRNAs来源基因主要富集于胞吞过程、cAMP信号通路、Rap1信号通路、Ras信号通路。对6种新发现的显著差异表达的circRNAs进行实时荧光定量PCR验证,结果显示,其表达水平与高通量测序结果趋势一致。【结论】本研究首次对SVA感染PK-15细胞的circRNAs表达谱进行差异分析,发现差异表达的circRNAs广泛参与动物机体大分子代谢、胞吞及细胞增殖、黏附、抗病毒过程,为进一步探究circRNAs在SVA感染过程中的分子机制提供了理论依据。

黑曲霉N14植酸酶基因在巴斯德毕赤酵母中的高效表达

从黑曲霉N14基因组DNA中扩增出植酸酶phyA基因表达片段 ,并将其克隆到pMD18 T载体中。以此片段构建了pPIC9K phyA重组表达载体 ,目的片段以正确的阅读框架插入到pPIC9K的多克隆位点EcoRⅠ和NotⅠ之间。重组表达载体经XbaⅠ线性化处理 ,电击转化毕赤酵母 ,经G4 18抗性筛选、酶活性测定、PCR鉴定和SDS PAGE分析 ,获得了两株产酶活性分别为 14 395 8 3u mL发酵液 (PP N14 2 2 )和 14 890 8 3u mL发酵液 (PP N14 4 4 )的高产工程菌 ,其酶活性分别是出发菌株酶活性 (4 2 2u mL)的 341 13倍和 35 2 86倍 ,重组酵母具有很好的遗传稳定性。重组植酸酶在pH值 2 5～ 3 0和 5 0～ 5 5时酶活性最高 ,且在pH4 5～ 6 5之间均有相当高的酶活性 ,最适作用温度为5 5℃。

植酸酶产生菌黑曲霉N14的诱变选育及其基因分析

以植酸酶产生菌黑曲霉03214为出发菌株,经紫外线和亚硝基胍诱变,获得了产酶活性较出发菌株提高了22.3%,达422IU/ml发酵液的突变菌株黑曲霉N14,其最适pH值为2.5,最适温度为50℃。通过对黑曲霉N14植酸酶phyA基因进行PCR扩增,获得了一条长约1.5kb的特异性产物。以pMD18 T为载体,构建了含有目的基因片段的重组质粒。DNA序列测定表明,目的基因片段含有植酸酶phyA基因的完整序列(GenBankAccession:AY426977),phyA基因全长1506bp,其中包含一段长102bp的内含子,编码467个氨基酸,有10个潜在的糖基化位点,5'端有一编码19个氨基酸的信号肽序列。实验结果为植酸酶基因工程菌的构建奠定了基础。

鸡肺炎克雷伯氏菌的分离鉴定

从自然病死鸡体内分离到一种革兰氏阴性的粗短杆菌，大小约０．５～０．９μｍ×０．８～１．６μｍ，两端顿圆或略尖，单个散在或两两相连，外有英膜包围，在麦康凯琼脂培养基上形成粘稠性粉红色菌落，不运动，不产生芽跑，经细菌学鉴定为肺炎克雷伯氏菌。该菌可致死小白鼠，对庆大霉素等药物敏感。

鸡肺炎克雷伯氏菌的生物学特性研究

鸡肺炎克雷伯氏菌可在２０～４５℃及ｐＨ５．５～１０范围内生长，最适生长温度为３７℃、最适ｐＨ值为７．０～７．６。在无盐条件下生长良好，最大能耐受８％ＮａＣｌ。该菌利用葡萄糖等产酸产气，利用构橡酸盐和尿素，Ｍ．Ｒ阴性．Ｖ－Ｐ阳性．不产生Ｈ＿２Ｓ和吲哚，不运动。对庆大霉素等药物敏感。小白鼠对本菌易感，家兔有抵抗力。

鲫和鳝红细胞C_3b受体的研究

本文应用免疫花环试验对鲫和鳝红细胞进行了检测。结果表明，鲫红细胞可形成Ｃ_３ｂ受体花环，花环率为７．９５±２．３３和免疫复合物花环，花环率为３．０５±１．１２。而鳝红细胞主要形成Ｃ_ｂ受体花环，花环率为３．９０±１．４２，免疫复合物花环率仅为０．２０±０．４２。正常鲫和鳝红细胞Ｃ_３ｂ受体花环率均高于红细胞免疫复合物花环率，差异极显著。这证实了鲫和鳝红细胞表面均存在Ｃ_３ｂ受体，从而表明二者的红细胞也具有重要的免疫功能。

恩诺沙星人工抗原的合成与鉴定

采用N-羟基琥珀酰亚胺活性酯法,将恩诺沙星(ENR)分别与牛血清白蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)连接,制备人工免疫原ENR-BSA和包被原ENR-OVA,经紫外扫描分析和动物免疫试验证实人工抗原合成成功,研究结果对抗恩诺沙星单克隆抗体的制备具有重要意义。

ELISA双抗体夹心法测定兔出血症病毒抗原

自刘胜江等报道兔出血症病毒(RHDV)以来,国内许多学者对该病毒的各种生物学特性进行了广泛研究,并取得了显著进展。但该病毒在各脏器组织中的动态分布尚未见报道。为此,我们应用酶联免疫吸附试验(ELISA)双抗体夹心法对其进行了研究。

鸡群混合感染肺炎克雷伯氏菌和葡萄球菌的诊断

1994年上半年重庆市某养鸡场蛋鸡群发病,呈持续散发性,并引起连续不断的死亡,多发生于产蛋鸡,主要病理变化为肝、脾、肾等实质器官肿大出血,口腔、喉头及气管内有大量白色粘稠液体等,使该养鸡场生产蒙受较大经济损失。经我们系统检查,确诊为鸡肺炎克雷伯氏菌和金色葡萄球菌的混翕感染,这在国内尚属首次发现,现报告如下。1 发病情况:该鸡场于1993年下半年引进万只即将生产的蛋鸡,引进后接种鸡减蛋综合征、新城疫等疫苗,饲粮中添加大蒜及0.07％的敌菌净。1994年初鸡群开始发病,呈散发性.多见于产蛋鸡,每天均有发病。

新城疫鸡胚免疫的研究

本文应用鸡新城疫（ＮＤ）Ⅱ系和Ｖ４弱毒疫苗分别气室接种不同孵化日龄鸡胚，出雏后计算其孵化率并在不同日龄测定血清ＨＩ抗体效价，结果表明，ＮＤⅡ系和Ｖ４疫苗１∶１０稀释，于１８、１９胚龄气室接种，对孵化率无显著影响（Ｐ＞００５），两种疫苗间也无明显差异（Ｐ＞００５），均能产生良好的免疫保护力。

对流免疫电泳检测鸡肺炎克雷伯氏菌抗原的研究

用对流免疫电泳检测鸡肺炎克雷伯氏菌抗原，结果表明，该法敏感、特异、快速、重复性好，且可用１％琼脂为载体，０．０５ＭｐＨ８．６巴比妥液为电泳缓冲液。

鲤红细胞C_3b受体的检测

对32例鲤红细胞检测表明,鲤红细胞除具有形成免疫复合物花环(花环率为4.22±1.54)外,还具有 C_3b 受体。能形成红细胞 C_3b 受体花环(花环率为8.17±1.99),二者差异显著,从而讧明鲤红细胞不但具有携氧、运输气体和调节体内酸碱平衡等作用,而且还有免疫功能。

K_1合剂对小鼠免疫功能的影响

试验表明，Ｋ１合剂能使小鼠脾重增加，循环抗体水平升高，腹腔巨噬细胞吞噬功能增强，外周血Ｔ淋巴细胞活性花环（Ｅａ）及α－醋酸萘酯酶（ＡＮＡＥ）阳性百分率上升．本研究结果提示。

鱼用嗜水气单胞菌口服疫苗的免疫保护效应

目的:制备含嗜水气单胞菌被膜或全菌的PLG疫苗微粒,以草鱼为实验动物,研究疫苗微粒的免疫保护效应。方法:采用复乳挥发法制备PLG疫苗微粒,草鱼口服免疫在4周内进行3次(每次10 mg微粒),用ELISA法测定血清和肠粘液的抗体变化,保护效应用细菌攻击实验检测。结果:获得被膜和全菌的PLG疫苗微粒,蛋白含量分别为2.31%,6.12%,2种疫苗微粒均可诱导血清及肠粘液抗体应答。腹腔接种20 LD50嗜水气单胞菌后,被膜、全菌疫苗微粒组的存活率分别为46.7%和36.7%,相对存活率分别为42.9%和32.1%,接受空微粒的草鱼仅有6.7%的存活率。结论:被膜、全菌疫苗微粒对草鱼均有显著免疫保护效应,可作为预防嗜水气单胞菌感染的疫苗。

6株牛源A型多杀性巴氏杆菌的分离与鉴定

2010年～2011年，重庆市多处肉牛场发生牛呼吸道感染致死性病例。从病牛肺组织中分离到多株病原细菌，经细菌形态和培养特性观察、生化试验、小鼠致病性试验及细菌16S rRNA 序列测定，其中6株初步鉴定为多杀巴氏杆菌（Pm）；进一步采用Pm种型特异性基因Kmt-1及hyaD-hyaC、bcbD、dcbF、ecbJ、fcbD PCR扩增，确定该6株Pm均为A型，分别命名为PmCQ （1～6）。对其部分生物特性比较分析表明，6株Pm在马丁肉汤和脑心浸液培养基中生长良好，PmCQ6相比其他几株菌平板培养菌落偏小；小鼠半数致死量（LD50）测定，PmCQ2毒力最强（2.2×10^5 cfu），PmCQ6毒力最弱（1.14×10^8 cfu）；药敏试验表明，6株菌对四环素、丙氟哌酸等多种药物敏感，无明显耐药性。

白鬼笔菌蕾的生长发育及出菇条件初探

通过对野生白鬼笔菌蕾进行无土处理及有土栽培分组,研究了不同大小的菌蕾在不同的温度条件下的生长发育及出菇情况。无土处理条件下,菌蕾直径过小时(d=0.2 cm^2.0 cm),在4℃~30℃范围都不能长出孢托,而直径大小在2.0 cm^6.0 cm的菌蕾在4℃~30℃范围内能够长出孢托,出菇的时间随着菌蕾的直径增大和温度的升高而提前。有土栽培条件下,不同直径大小(d=0.2 cm^6.0 cm)的菌蕾最终都能够长出孢托,原来较小的菌蕾经过一段时间的生长发育,到一定大小(d=3.5 cm^5 cm)后才能长出孢托出菇。所有结果表明,当菌蕾生长发育到一定阶段大小后,其长出孢托与有无土处理的关系不大,并且在4℃低温条件下都能出菇。

综合性大学兽医专业创新人才培养模式探索

针对我国兽医人才质量相对较低,远不能满足社会经济发展需求的现状,本文充分利用综合性大学独特的教学资源和师资优势,以改革原有培养模式为切入点,多渠道全方位提升学生的实践技能;以实施大学生创新计划为契机,全面提升学生的科研素质;以国际交流为抓手,培养学生的全球视野.围绕"厚基础、强技能、宽口径、善创新"的教学目标,构建了综合素质与专业技能并重的人才培养模式,按"1.5+2.5"框架设置教学课程,根据"一个目标、四个模块、一条主线、三个层次"的1413实验教学体系培养学生的实践技能,建立了学校、企业、行政管理部门三位一体的实践教学人才培养体系,为培养高素质创新型兽医人才探索了有效途径.

基于产学研结合的兽医专业学位研究生创新实践能力培养模式探索

本文探讨了当前兽医专业学位研究生培养过程中常见问题和不足,并通过探索产学研结合模式的兽医专业学位研究生培养新模式,加强校内外教学实习基地建设,优化"双师型"研究生导师队伍建设,完善研究生培养课程体系,强化国内外学术交流合作,重点培养具备创新意识和实践创新能力的高水平应用型专门人才,从而建立基于产学研结合的兽医专业学位研究生创新实践能力培养模式。