枸杞多糖对高糖诱导的晶状体上皮细胞凋亡的影响

目的观察枸杞多糖(LBP)对高糖诱导的人晶状体上皮细胞(SRA01/04)凋亡及SIRT1表达的影响。方法将SRA(OVOA)细胞随机分为正常对照组、高糖组及高糖+LBP低、中、高3个剂量组。各条件下培养48 h后采用CCK-8法检测各组细胞的活性,流式细胞技术(FCM)检测细胞的凋亡率,蛋白免疫印迹法检测各组细胞中SIRT1蛋白的相对表达量。结果 CCK-8结果显示,与正常对照组相比,高糖组细胞活性降低;而与高糖组相比,LBP高剂量组细胞活性升高,差异有统计学意义(P<0.05)。流式细胞术显示,与正常对照组相比,高糖组细胞凋亡率显著上升;与高糖组相比,LBP组细胞凋亡率显著下降,差异有统计学意义(P<0.05)。蛋白印迹法结果显示,与正常对照组相比,高糖组细胞中的SIRT1蛋白表达降低;与高糖组相比,LBP组细胞中的SIRT1蛋白表达升高,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 LBP可能通过调节SIRT1的表达对高糖环境下人晶状体上皮细胞凋亡产生抑制作用。

紫外线照射对人视网膜色素上皮细胞活性和沉默信息调节因子6(SIRT6)表达的影响

目的探讨紫外线照射对人视网膜色素上皮细胞(ARPE-19细胞)活性和沉默信息调节因子6(SIRT6)表达的影响。方法将对数生长期的ARPE-19细胞按照照射剂量随机分为对照组(0 mJ·cm^(-2))及7.5 mJ·cm^(-2)、15.0 mJ·cm^(-2)、30.0 mJ·cm^(-2)、60.0 mJ·cm^(-2)、120.0 mJ·cm^(-2)、240.0 mJ·cm^(-2)照射剂量组进行干预培养。照射后继续常规培养24 h,采用倒置荧光显微镜观察细胞形态并拍照,CCK-8法检测细胞存活率,Western blot检测各组细胞中SIRT6的表达情况,采用免疫荧光染色对对照组、30.0 mJ·cm^(-2)照射剂量组和240.0 mJ·cm^(-2)照射剂量组ARPE-19细胞中SIRT6进行定位检测。结果对照组ARPE-19细胞呈梭形贴壁生长,边界清楚,连接紧密,细胞状态良好;30.0 mJ·cm^(-2)照射剂量组ARPE-19细胞形态不规整,细胞数量略有减少,细胞间连接疏松。CCK-8法检测结果显示与对照组相比,ARPE-19细胞在不同剂量紫外线照射后,细胞存活率显著降低且呈剂量依赖性(均为P<0.05)。与对照组相比,除较低照射剂量组(7.5 mJ·cm^(-2)、15.0 mJ·cm^(-2))外,其余各组SIRT6蛋白相对表达量均降低,且随着照射剂量的增加呈剂量依赖性逐渐降低(均为P<0.05)。经过30.0 mJ·cm^(-2)紫外线照射后,ARPE-19细胞随着再培养时间的延长,细胞中SIRT6蛋白的相对表达量逐渐下降(均为P<0.05)。对照组、30.0 mJ·cm^(-2)照射剂量组和240.0 mJ·cm^(-2)照射剂量组SIRT6主要表达于ARPE-19细胞核内;与对照组相比,30.0 mJ·cm^(-2)照射剂量组和240.0 mJ·cm^(-2)照射剂量组ARPE-19细胞中SIRT6的荧光强度显著降低,且240.0 mJ·cm^(-2)照射剂量组降低更明显。结论紫外线照射能够降低ARPE-19细胞的增殖活性,同时也能下调细胞中SIRT6的表达。

高糖对人晶状体上皮细胞沉默信号调节蛋白6(SIRT6)表达的影响

目的观察高浓度葡萄糖对人晶状体上皮细胞(SRA01/04)活性及沉默信号调节蛋白6(SIRT6)表达的影响。方法将SRA01/04细胞在不同葡萄糖浓度(5.5 mmol·L^-1、15.5 mmol·L^-1、25.5 mmol·L^-1、35.5 mmol·L^-1、45.5 mmol·L^-1、55.5 mmol·L^-1、75.5 mmol·L^-1)培养基中培养48 h后,用光镜观察SRA01/04细胞形态;CCK-8试剂盒检测各组细胞的活性;Western blot检测各组细胞SIRT6蛋白的表达水平。然后将SRA01/04细胞用55.5 mmol·L^-1葡萄糖干预,培养不同时间(0 h、6 h、12 h、24 h、48 h、72 h)后,Western blot检测不同时间SRA01/04细胞SIRT6蛋白表达水平。免疫荧光技术检测对照组(5.5 mmol·L^-1葡萄糖)和高糖组(55.5 mmol·L^-1葡萄糖)细胞的SIRT6蛋白表达情况。结果随着葡萄糖浓度增加,SRA01/04细胞的数量逐渐降低。CCK-8检测结果显示,与5.5 mmol·L^-1葡萄糖组相比,随着葡萄糖浓度增加,SRA01/04细胞的活性逐渐降低,差异均有统计学意义(均为P<0.05)。Western blot检测结果显示,SRA01/04细胞的SIRT6蛋白表达与葡萄糖呈浓度和时间依赖性,45.5 mmol·L^-1、55.5 mmol·L^-1、75.5 mmol·L^-1葡萄糖组与5.5 mmol·L^-1葡萄糖组比较,以及24 h组、48 h组和72 h组与0 h组比较,差异均有统计学意义(均为P<0.05)。细胞免疫荧光结果显示,SRA01/04细胞中的SIRT6蛋白主要在细胞核表达,高糖组SRA01/04细胞中SIRT6蛋白表达较对照组显著降低(P<0.05),且高糖组细胞核出现明显的核固缩和核碎裂现象。结论高浓度葡萄糖可以降低SRA01/04细胞的增殖活性,降低SIRT6蛋白的表达水平。

构建干扰多梳状蛋白2的人胶质瘤U251细胞系

目的建立稳定干扰多梳状蛋白2(polycomb like 2,PCL2)的人胶质瘤U251细胞系。方法针对PCL2基因的shRNA克隆至miR30前体骨架shRNA表达载体,用PCR鉴定载体构建成功后转入HEK293细胞,得到重组腺病毒Ad5-E1-AmU6-PCL2 shRNA-E3-CMV-eGFP;将重组腺病毒转染至U251细胞中,分组为空白对照组、空载体组和PCL2 shRNA组,滴度梯度设置为MOI(20∶1,50∶1,100∶1),使用荧光显微镜观察腺病毒感染效率;用Western blot检测U251细胞内shRNA PCL2表达载体的基因沉默效率。结果使用小RNA干扰技术,成功构建了表达PCL2 shRNA的重组腺病毒;荧光显微镜观察发现MOI(50∶1)时,U251细胞感染效率最高,细胞生长状态良好。Western blot结果显示PCL2 shRNA重组腺病毒组的PCL2蛋白水平较空白对照组和空载体组明显降低,以100∶1时的PCL2表达量最低,干扰效果最显著。结论成功构建的PCL2 shRNA重组腺病毒能够在体外有效感染U251细胞,降低U251细胞中PCL2的蛋白表达并筛选出稳定沉默的细胞系。