β-酪啡肽-7对大鼠生长、相关激素及生长素受体mRNA表达的影响

目的: 探讨β-酪啡肽-7(β-CM-7)对大鼠生长、生长相关激素和生长因子以及生长素受体(GHR)mRNA表达的影响。方法: 将30只生长期雄性SD大鼠随机分为对照组和实验组,分别被灌饲生理盐水和β-CM-7,并记录大鼠日采食量。饲养1个月后检测大鼠的增重情况,应用放射免疫法测定血清中生长相关激素和生长因子的含量,用相对定量RT-PCR法研究两组大鼠肝脏GHR mRNA表达水平的差异。结果: 实验组大鼠与对照组比,增重有提高的趋势,增重率提高8.67%。实验组大鼠的日采食量增加了13.08%(P<0.05)。与对照组相比,实验组大鼠血清中生长激素(GH)和胰岛素显著或极显著升高(P<0.05或P<0.01),三碘甲腺原氨酸(T3)和胰岛素样生长因子-I(IGF-I)有升高趋势,而甲状腺素(T4)有下降趋势。实验组大鼠肝脏的GHR mRNA表达水平显著提高(P<0.05),增加了19.83%。结论: β-CM-7能促进生长期大鼠的生长,增加采食量,影响生长相关激素和生长因子的分泌,并且上调肝脏GHR mRNA表达水平,从而增加生长激素的敏感性。

抗B血型物质单克隆抗体的研制及其免疫学特性的研究

应用杂交瘤技术,分别以人B血型红细胞,B血型红细胞加纯化的B血型物质和B血型物质为抗原,采用不同免疫程序免疫BALB/C小鼠,从6次细胞融合中筛选建立起3株分泌高滴度,高特异性抗人B血型物质单克隆抗体的杂交瘤细胞株:3—3—D_9(IgG_1),3—5—D_(12)(IgG_1)和6—1—G_(11)(IgA),用Takatsy微量血凝滴定法测得它们的96孔板组织培养上清液的血凝滴度分别为4096,4096和16384。经过凝血特异性试验,凝血抑制试验以及抗体稀释试验等广泛免疫化学研究证明这些单克隆抗体仅对人B型血特异。杂交瘤细胞在液氮中贮存数月,分泌抗体能力不变。抗体经56℃保温30minA-20℃和37℃反复冻融试验凝血活性保持稳定。这些单克隆抗体为进一步研究B血型抗体结合部位结构的多样性提供了条件,并且使在临床血液分型试验时用单克隆抗体替代人多克隆抗血清成为可能。

初乳中主要组分的动态变化及产妇年龄和剖宫产的影响

测定了来自20位健康母亲(其中8位为剖宫产)的118份初乳(泌乳第1～7d)中乳糖和蛋白质浓度。通过线性模型,分析产妇年龄和剖宫产对乳糖和蛋白质含量的影响。结果表明,乳糖在泌乳第1d最低,在泌乳1w内增加,其中泌乳第1d的乳糖浓度极显著低于第7d(P<0.01)。乳蛋白的浓度在泌乳第1d最高,泌乳1w内下降,其中前3d水平显著或极显著高于第7d(P<0 05或P<0 01)。初乳中乳糖和乳蛋白含量呈极显著负相关(r=-0.523,P<0.01)。剖宫产母亲初乳中乳糖含量显著低于顺产(P<0 05),剖宫产与顺产母亲初乳中蛋白质含量差异不显著(P>0 05)。产妇年龄的大小与初乳中蛋白质和乳糖含量均无显著关系(P>0 05)。

N-乙酰半胱氨酸体外下调IL-8、IL-6及TNFα在PBMC中的表达

目的 研究N 乙酰半胱氨酸(NAC)体外对白细胞介素 8(IL 8)、白细胞介素 6(IL 6 )及肿瘤坏死因子α(TNFα)在外周血单核细胞 (PBMC)中表达的影响。方法 分离新鲜外周血PBMC,以PMA、A23187刺激PBMC,同时加入不同浓度的NAC,通过ELISA、RT PCR方法分别测定培养上清IL 8、IL 6及TNFα水平及细胞中相应mRNA水平。结果 通过PMA、A23187刺激的PBMC培养上清中的IL 8、IL 6及TNFα水平及细胞中的mRNA水平显著升高(P<0 01)。加入NAC(0、3、10、20mmol/L) 3h细胞中IL 8、IL 6及TNFα的mRNA水平显著降低(P<0 01)。24h后培养上清中IL 8、IL 6及TNFα水平明显低于PMA及A23187刺激的上清(P<0 01);且具有剂量依赖关系 (P<0 01 )。结论 NAC体外可以下调PMA、A23187刺激PBMC表达IL 8、IL 6及TNFα。

人白细胞介素29在cos-7细胞中表达及其体外抗乙型肝炎病毒作用

目的：克隆人细胞因子IL-29全长cDNA及其在cos-7细胞中表达，并初步探讨表达产物体外抗乙肝病毒（HBV）作用。方法：分离外周血单个核细胞；VSV感染后，提取总RNA，通过一步法RT-PCR获得IL-29全长cDNA。DNA测序正确后，将IL-29 cDNA的编码框序列构建到真核表达载体psectagB/His-myc中。氨苄青霉素板筛选及PCR鉴定，挑出阳性克隆进行扩增、转染cos-7细胞并经潮霉素及有限稀释法筛选稳定表达克隆。SDS-PAGE、Western blot鉴定，Ni2＋亲和层析分离纯化得到主带分子量为33000组氨酸标签重组人IL-29融合蛋白。体外以HepG2.2.2.15为靶细胞观察rhIL-29对HepG2.2.2.15培养上清液中HBV表面抗原（HBsAg）及e抗原（HBeAg）影响。结果：成功获得人IL-29全长cDNA并在cos-7细胞中稳定表达。SDS-PAGE、Western blot分析显示表达的rhIL-29融合蛋白为几个蛋白质区带，分子量在20000-33000之间纯化的rhIL-29融合蛋白，主带在33000附近。rhIL-29融合蛋白具有抑制HBsAg及HBeAg分泌作用并且具有剂量效应，抑制率分别达85%。结论：获得具有生物活性的rhIL-29融合蛋白。rhIL-29融合蛋白在体外具有抑制HepG2.2.2.15细胞分泌HBsAg及HBeAg作用。

人白细胞介素-21cDNA克隆及其在大肠杆菌系统的表达

目的 :克隆人细胞因子IL 2 1全长cDNA及其在大肠杆菌中表达 ,并进一步检测其表达产物的功能。方法 :抽取外周血 ,分离淋巴细胞 ;抗CD3抗体刺激后 ,提取总RNA ,通过RT PCR获得两个部分重叠的IL 2 1cDNA片段 (分别为 5′端 2 4 2bp ,3′端 4 2 5bp) ,重组PCR扩增出IL 2 1全长cDNA。DNA测序正确后 ,将成熟IL 2 1cDNA的编码框序列构建到原核表达载体pET2 8a(+)中。卡那霉素平板筛选及PCR鉴定 ,挑出阳性克隆进行扩增、转化大肠杆菌进行IPTG诱导表达。SDS PAGE、Westernblotting鉴定 ,亲和层析分离纯化得到Mr 为 186 0 0的带有组氨酸标签重组人IL 2 1融合蛋白。透析法重折叠复性 ,MTT法测定其对T细胞增殖活性。结果 :成功获得人IL 2 1全长cDNA ,并以包涵体形式表达于大肠杆菌中。重折叠后的rhIL 2 1融合蛋白具有与抗CD3抗体共刺激T细胞增殖作用。结论 :获得具有生物学活性的rhIL 2 1细胞因子 ,为进一步研究其功能奠定基础。

hVEGF165基因克隆及其在COS-7细胞中的表达

目的克隆人血管内皮生长因子(hVEGF)基因VEGF165片段,构建pcDNA3.1/hVEGF165,观察其在COS-7细胞中的表达,为基因治疗缺血性心脏病的研究奠定基础。方法从合法引产的胎儿心肌组织中提取总核糖核酸(RNA),应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法获得hVEGF165基因,将其重组入T载体,聚合酶链反应(PCR)法鉴定并测序,双酶切后克隆入真核表达载体pcDNA3.1/myc-his-B中,构建pcDNA3.1/hVEGF165重组体。用脂质体介导将其转染COS-7细胞,蛋白印迹(Westernblotting)法检测rhVEGF165的表达蛋白。结果用RT-PCR方法从胎儿心肌组织中获得了正确的hVEGF165基因序列,并成功构建pcDNA3.1/hVEGF165,且实现转染COS-7细胞的瞬时表达。结论构建的pcDNA3.1/hVEGF165转染真核细胞COS-7能够表达rhVEGF蛋白。

N-乙酰半胱氨酸体外抗乙肝病毒作用

目的 :探讨NAC体外抗乙肝病毒活性及其机制。方法 :体外以转染了乙肝病毒的HepG2 2 2 15细胞株作为实验对象 ,培养细胞中加入不同浓度的NAC( 0 ,3 ,10 ,3 0mmol/L)。用酶联免疫吸附法 (ELISA )测定培养上清液中的乙肝表面抗原 (HBsAg)、e抗原 (HBeAg)。半定量PCR测定细胞内及培养上清液中的HBVDNA的变化 ,RT PCR分析细胞内HBV表面抗原mRNA的变化。结果 :NAC对HBsAg、HBeAg均有抑制作用 ,但NAC对HBsAg的抑制较HBeAg强 ,抑制率达 90 %左右。且抑制作用具有剂量和时间依赖性。半定量PCR结果显示细胞内的HBVDNA含量随着NAC浓度的增加而升高 ,而培养上清中的HBVDNA的含量降低。RT PCR结果表明细胞内HBsAgmRNA没有显著变化。结论 :NAC体外具有抗HBV活性 ,其抑制作用发生在转录后水平。

人白细胞介素21在真核细胞中表达及其体外促T细胞增殖作用

目的 :构建人细胞因子IL 2 1表达载体并在Hela细胞中稳定表达 ,分析rhIL 2 1体外促T细胞增殖作用。方法 :以已构建的pMD IL2 1为模板 ,PCR扩增成熟IL 2 1cDNA的编码框序列并构建到真核表达载体pCDNA3 1/hismyc B中。挑出阳性克隆进行扩增 ,脂质体转染入Hela细胞中并以G4 18加压筛选。有限稀释法、RT PCR及Westernblot筛选出稳定表达的细胞株。培养上清液经金属离子螯合层析分离纯化后 ,SDS PAGE、Westernblot鉴定。MTT法测定其与抗CD3单克隆抗体共刺激T细胞增殖活性。结果 :SDS PAGE、Westernblot显示Mr为 180 0 0的带有myc重组人IL 2 1融合蛋白 (rhIL 2 1) ;并成功地获得hIL 2 1稳定表达细胞株。rhIL 2 1融合蛋白具有与抗CD3抗体共刺激T细胞增殖作用。结论 :获得具有生物学活性的rhIL 2 1细胞因子 ,为进一步研究其功能奠定基础。

医学院校生化教学面临的问题和改革的探讨

生物化学是医学院校重要的基础课 ,也是当代医学和生物学中的前沿学科。然而医学院校的生化教学面临许多问题和挑战。本文论述了医学院校生物化学教学面临的五个问题 。

鼠抗人A_1亚型红细胞单克隆抗体研制及其免疫学性质研究

应用杂交瘤技术，以２种抗原分别免疫ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠。从３次细胞融合中，筛选出４株分泌高滴度、高特异性抗Ａ１血型物质单克隆抗体的杂交瘤细胞系。经多种免疫化学试验证明：其中Ｂ５２３－Ｈ１０、Ｄ２４３－Ｈ９２株杂交瘤扩大培养上清液仅凝集Ａ１红细胞，而不凝集Ａ２、Ｂ、Ｏ型红血胞。它们结合部位的结构互补于：人工接上脂肪链的Ａ－活性三糖。从而表明该２株单抗为首次获得的抗Ａ１亚型红细胞单克隆抗体。不仅为研究Ａ１亚型血本质提供了极好的材料，也为医学临床提供Ａ１亚型血分型试剂准备了条件。

pcDNA3.1/hVEGF165的构建及其在COS-7细胞中的表达

目的 克隆人血管内皮生长因子基因VEGF165片段,构建pcDNA3·1 /hVEGF165,观察其在COS 7细胞中的表达,为基因治疗缺血性心脏病奠定基础。方法 从胎儿心肌组织中提取总RNA,应用RT PCR方法获得hVEGF165基因,将其重组入T载体,PCR法鉴定并测序,双酶切后克隆入真核表达载体pcDNA3 1 /myc his B中,构建pcDNA3 1 /hVEGF165重组体。用脂质体介导将其转染COS 7细胞,WesternBlotting方法检测rhVEGF165的表达蛋白。结果 RT PCR方法从胎儿心肌组织获得正确的hVEGF165基因序列,成功构建pcDNA3·1 /hVEGF165且实现转染COS 7细胞的瞬时表达。结论 该实验构建的pcDNA3· 1 /hVEGF165转染真核细胞COS 7能够表达rhVEGF蛋白。

重组人乙酰胆碱受体原核表达条件的优化及初步应用

在已建立的重组人乙酰胆碱受体表达质粒的基础上进一步优化试验条件,初步应用于ELISA分析实验性重症肌无力模型(EAMG)中抗体的滴度。取构建好的pET28a(+)-hAChRα1-210经小规模诱导,确定IPTG诱导的最佳浓度为0.006mmol/L,最佳时间为5h,最佳温度为37℃;大规模诱导培养后离心,超声得到菌体沉淀,1mol/L尿素洗涤后8mol/L尿素溶解,过Ni2+亲和层析柱,紫外吸收及Folin酚法确定表达量较多而蛋白最纯的4℃透析过夜,PEG8000浓缩后免疫雌性近交系Lewis鼠构建EAMG,ELISA检测分析模型大鼠血清中抗体的效价。结果表明,制备了大量较纯的rhAChR,并成功应用于ELISA法分析EAMG模型中抗体的滴度。因此,获得的纯化rhAChR可用于构建EAMG模型及鉴定。

人白细胞介素-29cDNA克隆及其在大肠杆菌系统的表达

目的:克隆人细胞因子IL-29全长cDNA及其在大肠杆菌中表达,制备抗IL-29多克隆抗体。方法:分离外周血单核细胞;vsv感染后,提取总RNA,通过一步RT-PCR获得IL-29全长cDNA。DNA测序正确后,将IL-29cDNA的编码框序列构建到原核表达载体pET28a(+)中。卡那霉素平板筛选及PCR鉴定,挑出阳性克隆进行扩增、转化大肠杆菌进行IPTG诱导表达。SDS-PAGE、Westernblotting鉴定,亲和层析分离纯化得到Mr为23000组氨酸标签重组人IL-29融合蛋白。纯化的IL-29免疫家兔制备抗IL-29多克隆抗体。结果:成功获得人IL-29全长cDNA,并以包涵体形式表达于大肠杆菌中。免疫家兔后获得特异抗IL-29的多克隆抗体。结论:获得rhIL-29细胞因子及其多克隆抗体,为其进一步研究及应用奠定基础。

人白细胞介素15基因克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的克隆人白细胞介素(IL)15全长cDNA,并在大肠杆菌中表达。方法从人外周血分离的淋巴细胞中提取总RNA,通过RT-PCR扩增出hIL-15全长cDNA。构建到原核表达载体pET28a(+)中,通过卡那霉素平板筛选及PCR鉴定,挑出阳性克隆进行扩增,DNA测序正确后,转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,扩增后IPTG诱导表达。通过SDS-PAEG及Western-blot方法鉴定表达的融合蛋白。结果成功构建人IL-15表达载体,并表达于大肠杆菌中。SDS-PAEG及Western-blot分析显示表达的融合蛋白分子量为16·1ku,与理论值相符。结论获得了hIL-15融合蛋白,为hIL-15单克隆抗体的制备及其功能研究奠定了基础。

新药坎地沙坦酯的核磁共振谱分析

目的 用核磁共振方法鉴定新药坎地沙坦酯的结构。方法 应用HMQC、HMBC等二维核磁共振技术进行测定。结果 对新药坎地沙坦酯的1H NMR和13C NMR谱信号进行了全归属。

A血型单克隆抗体的抗原结合部位结构多样性研究

应用杂交瘤技术，以Ａ型红细胞，Ａ１血型物质ＭＳＭ（Ａ１）和Ａ－ＲＢＣ＋ＭＳＭ（Ａ１）为免疫原，制备了一组抗人Ａ血型单克隆抗体：Ａ１２１８，Ｂ５７，ＤＥ９２３－Ｇ８，Ｄ２８６－Ｅ１２经Ｔａｋａｔｓｙ微量血细胞凝集试验证明：这组单抗仅能凝集Ａ１，Ａ２及ＡＢ型红细胞，不能凝集Ｂ，Ｏ型红细胞．采用ＥＬＩＳＡ定量抑制试验法，精确测定了它们抗原结合部位的结构，互补于Ａ活性寡糖。Ａ１２１８互补于具有双岩藻糖结构的Ａ活性五糖（Ａ－Ｐｅｎｔａ）；Ｂ５７，ＤＥ９２３－Ｇ８互补于具有单岩藻糖结构的Ａ活性六糖（Ａ－Ｈｅｘａ）；而Ｄ２８６－Ｅ１２则互补于具有单岩藻糖的Ａ活性四糖（Ａ－Ｔｅｔｒａ）．结果表明：血凝特异性相同的抗Ａ单抗，其抗原结合部位的结构可呈现多样性。即Ａ活性寡糖的糖基组成数目和含有岩藻糖数目均可不相同，各种抑制剂对不同单抗的抑制作用强弱也不相同。

A、B血型单克隆抗体临床应用的研究

为了探索人血型分型试剂工业化生产的可能性，应用人Ａ、Ｂ血型单克隆抗体，进行了抗体特性及临床血型分型的研究。经血凝特性试验，测得Ｄ２８６－Ｅ１２单克隆抗体仅对Ａ血型特异，６－１－Ｇ１１单克隆抗体仅对Ｂ血型特异。由盐水试管法测得它们的血凝滴度均为１：５１２。以血库常规人抗Ａ、抗Ｂ血清为标准对照，采用盐水试管法，对３７０４例血液样品进行了临床血型分型试验。结果显示，Ａ、Ｂ血型单克隆抗体分型试剂与标准人血清１００％相符。证明：Ｄ２８６－Ｅ１２和６－１－Ｇ１１两株杂交瘤分泌的Ａ、Ｂ血型单克隆抗体可作为非常优越的血型分型试剂。具有工业化生产血型单克隆抗体的潜力。