禽流感病毒M2e基因与鸡IgG Fc基因在巴斯德毕赤酵母中的融合表达

【目的】得到融合蛋白M2e-Fc,并检测其免疫学特性,为研制禽流感通用疫苗奠定基础。【方法】根据禽流感病毒H5N1的M2e蛋白氨基酸序列设计2条长互补引物,通过重叠区互补扩增基因法扩增出目的基因M2e,然后与鸡IgGFc片段基因一起克隆入毕赤酵母表达质粒中,构建酵母表达载体。将阳性质粒线性化后电转化入感受态毕赤酵母X-33中,再经甲醇诱导后,通过Tricine-SDS-PAGE电泳及Western-blotting鉴定融合蛋白。之后用其免疫非免疫鸡,检验其免疫原性。【结果】成功构建了表达M2e和Fc融合蛋白的酵母表达载体pPICZαA-M2-Fc,并通过Zeocin筛选及PCR鉴定出了阳性重组子;阳性重组子经甲醇诱导后得到融合蛋白,Tricine-SDS-PAGE电泳及Western-blotting鉴定证实,融合蛋白得到正确表达,并且可以与M2e阳性血清反应。动物免疫试验证实,该融合蛋白可以诱导鸡产生抗M2e抗体,具有良好的免疫原性。【结论】融合蛋白M2e-Fc在巴斯德毕赤酵母表达系统中得到了成功表达,该融合蛋白具有较好的免疫原性,为后期进行其他免疫试验奠定了基础。

禽流感病毒M2e特异性多肽ELISA检测方法的建立

本研究人工合成禽流感病毒H5N1亚型M2蛋白的膜外区(M2e),并偶联至半抗原载体血蓝蛋白(KLH),免疫SPF鸡,共免疫3次,每次间隔两周。所获得的阴阳性血清用于ELISA方法的建立,通过方阵滴定确定了人工合成的23肽包被96孔ELISA板的最佳浓度为5μg/mL;1%BSA为封闭液,37℃封闭3 h;被检测血清的最佳稀释度为1∶400,一抗反应时间为37℃,45 min;二抗反应时间为37℃30 min;选用TMB为底物,显色15 min,用2 mol/L H2SO4为终止液为检测血清中抗M2e抗体滴度奠定基础。根据建立的ELISA方法,检测3次免疫2周后的SPF鸡血清中抗M2e抗体,血清开始1∶100倍稀释之后做倍比稀释,测得平均滴度分别为1∶13 500和1∶20 500。

以人结核杆菌hsp70为载体的“通用型”禽流感疫苗构建及免疫效力研究

化学合成H5N1亚型禽流感病毒M2蛋白N端胞外域基因序列3拷贝基因(3M2e),与人结核杆菌hsp70蛋白基因融合,克隆至原核表达载体pET-32a(+),构建表达载体pET-3M2e与pET-3M2e-hsp70。重组质粒转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导重组蛋白获得表达,通过镍亲和层析获得纯化的融合蛋白,利用Western blot鉴定重组蛋白免疫原性。将纯化的重组蛋白免疫20日龄的禽流感非免鸡,以人工合成的M2e与KLH偶联后免疫鸡作为阳性对照,以pET-32a(+)载体蛋白注射组作为阴性对照,初免后2周加强免疫。通过抗M2e抗体检测、细胞病变抑制试验与间接免疫荧光试验评价重组蛋白免疫后产生的体液免疫反应;利用流式细胞分群及细胞因子产量检测评价重组蛋白免疫后产生的细胞免疫反应。加强免疫后4周用100EID50的H9N2亚型AIV攻毒,通过Real-time PCR检测攻毒后3、5、7天免疫鸡泄殖腔棉拭子中病毒的含量。结果表明,重组蛋白3M2e hsp70免疫组能够刺激免疫鸡产生较高的抗体水平及细胞免疫应答,并且攻毒后泄殖腔棉拭子中病毒含量明显降低。