细粒棘球蚴特异性诊断抗原Eg-07279的制备及免疫原性研究

目的筛选出包虫病特异性诊断抗原分子并验证其免疫原性。方法对国家人类基因组南方研究中心公布的细粒棘球绦虫测序数据进行分析,利用生物信息学的方法筛选出六钩蚴中不表达且原头蚴中高表达的抗原分子Eg-07279,经重组克隆、表达后用亲和层析法纯化获得重组蛋白r Eg-07279;重组蛋白免疫小鼠检测其特异性IgG水平并使用Western blot验证其免疫原性。结果筛选出的抗原分子Eg-07279经克隆、表达、纯化获得重组蛋白。利用该重组蛋白免疫小鼠,ELISA检测结果显示Eg-07279产生的特异性IgG水平(2.559±0.125)明显高于空白组(0.319 0±0.01),差异有统计学意义(P<0.01);Western blot检测结果显示原头蚴继发感染组和重组蛋白免疫组血清均可识别该重组蛋白而空白对照组鼠血清不能识别。结论获得细粒棘球蚴差异表达抗原Eg-07279并证实该重组蛋白具有较好的免疫原性,是较好的诊断抗原候选分子。

菜用枸杞叶的营养价值及营养等级评价

将菜用枸杞叶（VWL）分为芽尖、茎、未成熟叶片和成熟叶片等4个部位,分别研究了这4个部位的营养成分,结果发现：4个部位均含有丰富的多糖、矿质元素、生物碱和维生素,尤其是芽尖和成熟叶片。在这4个部位中,芽尖的多糖、生物碱和氨基酸含量最高,多糖含量为7.6%、生物碱含量为49.64mg/100g、氨基酸总量为6.23%;成熟叶片的β-胡萝卜素（5.63mg/100g）、维生素C（20.6mg/100g）和钙（319.67mg/100g）的含量最高,多糖含量也相当高。按照平均营养价值估算法（ANV）对VWL进行营养等级评价,VWL 4个部位的ANV值为5.87~13.41;按照营养评分分类估算法,VWL 4个部位营养评分为10~17分,属于一级蔬菜。本研究可以为VWL的开发利用提供科学依据。

缺氧对大鼠心肌细胞损伤的影响及机制

目的探讨缺氧对大鼠心肌细胞系H9C2的损伤及机制。方法在1%O_2+5%CO_2+94%N_2条件下培养大鼠心肌细胞株H9C2 3、6、12、24、48 h,并以正常大鼠心肌细胞株作对照,使用台盼蓝进行细胞计数;CCK-8法检测细胞存活率;实时监测心肌细胞生长状态;透射电镜观察细胞内部结构;活性氧检测试剂盒检测胞内活性氧(ROS);Western印迹法检测线粒体色素C蛋白表达水平;流式细胞术检测细胞凋亡率;乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒检测细胞坏死程度。结果缺氧状态下,随着缺氧时间的不断增加,大鼠心肌细胞株H9C2的细胞生长、存活率均明显降低、细胞形态明显改变,细胞器结构明显损伤,ROS水平升高,线粒体细胞色素释放增加,细胞凋亡率明显增加,LDH的释放率明显增高。结论缺氧会造成大鼠心肌细胞的生长速度减慢、形态改变及心肌线粒体损伤,最终导致细胞凋亡和细胞坏死。

《金蝉脱壳》教学设计

【设计理念】这篇课文叙写了＂我＂亲眼目睹＂金蝉脱壳＂的完整过程,清晰地展示了＂金蝉脱壳＂这一奇特动人的情景。在本节课的教学中,我设想在重点＂金蝉脱壳＂这个过程教学中,引导学生通过读书去感悟课文内容,感受金蝉脱壳的奇特动人。教学中教师应着重凭借文本语言,让学生在比较中鉴赏、甄别、感悟、学习仔细观察和细致描写的方法,让学生明白神奇的一切靠自己去发现,从而激发学生乐于观察周围事物的兴趣。

认知方式，提高小学生语文阅读能力的基石

每个学生都是不同的个体，他们在思维方式与心理发展水平上都存在不同的个体差异与群体差异。因此，在小学语文阅读教学中要倡导个性化，遵循学生的认知差异，探讨差异教学的新方法、新策略。本文围绕如何优化学生的认知方式进行阐述，旨在提高阅读教学的效果。

细粒棘球绦虫重组P29蛋白对原头蚴感染小鼠肝脏组织中TLR4及NF-кB表达的影响

目的观察细粒棘球绦虫重组P29蛋白(rP29)对原头蚴感染的小鼠肝脏组织Toll样受体(TLR4)与核因子-κB(NF-κB)表达变化的影响。方法36只BALB/c的雌性小鼠,每组12只,随机分为PBS组、佐剂组和重组P29蛋白免疫组(rP29组)。PBS组和佐剂组分别注射相应的PBS和佐剂;rP29组小鼠于皮下多点注射细粒棘球绦虫重组P29蛋白(10μg/只),分别于第2、4周加强免疫;于末次免疫后2周,3组BALB/c小鼠均腹腔接种细粒棘球蚴原头蚴(1500个/只);感染后24周,摘眼球取血,处死小鼠取肝脏,切片苏木素-伊红染色(HE)观察小鼠肝脏组织的形态,Real Time PCR和Western blot法检测小鼠组织中TLR4、NF-κB-p65基因的相对表达量和蛋白表达水平。结果重组P29蛋白组肝细胞边界清楚、排列整齐,偶见炎性细胞浸润,而对照组出现较多炎性细胞浸润。重组P29蛋白组小鼠肝脏组织中的TLR4 mRNA的相对表达量为1.74±0.52,对照PBS组和佐剂组分别为1.0±0.02和1.12±0.16;重组P29蛋白组小鼠肝脏组织中的NF-κB-p65 mRNA的相对表达量为3.45±0.17,对照PBS组和佐剂组分别为1.0±0.01和2.65±0.48。重组P29蛋白免疫组TLR4和NF-κB-p65 mRNA相对表达量均高于PBS组和佐剂组。同时,重组P29蛋白组小鼠肝脏TLR4和NF-κB-p65蛋白表达量与PBS组和佐剂组相比均增高。结论重组P29蛋白能够增加细粒棘球蚴感染小鼠肝脏组织中TLR4、NF-κB-p65 mRNA和蛋白的表达。

细粒棘球蚴重组蛋白P29(rEg.P29)诱导下差异表达microRNA的筛选及分析

目的对细粒棘球蚴重组蛋白P29(rEg.P29)诱导小鼠差异表达的microRNA进行筛选和分析,以期为rEg.P29免疫前后宿主免疫细胞的分化研究提供线索。方法将6-8周龄SPF级BALB/c小鼠随机分为2组,rEg.P29免疫组和对照组,每组12只。rEg.P29免疫组于小鼠腹部多点免疫重组蛋白100μl(含rEg.P2910μg),共免疫2次,第1次免疫2周后进行第2次免疫。提取第2周(第1次免疫后2周)、第6周(第1次免疫后4周)、第8周(第1次免疫后6周)各组小鼠外周血淋巴细胞,分离microRNA用于建库测序,利用生物信息学方法筛选rEg.P29诱导下差异表达的microRNA分子,并进行注释分析。结果测序所得数据经拼接组装比对,共获得成熟的microRNA序列342条,其中已知的microRNA序列206条,未知信息序列36条。在已知的microRNA分子中,差异表达共55个,其中上调31个,下调24个;在新发现的microRNA分子中,差异表达11个,其中上调5个,下调6个。靶基因预测结果显示,表达上调microRNA调控的靶基因有14279个,表达下调microRNA调控的靶基因13911个。GO富集注释结果显示,在上调分子中,生物学进程(BP)获得18条注释信息,其中16个microRNA调控的826个靶基因被注释到细胞分化(cell differentiation)条目下;在下调分子中,生物学进程(BP)获得21条注释信息,其中25个microRNA调控的712个靶基因被注释到细胞分化(cell differentiation)条目下。KEGG通路分析结果显示,无论是表达上调还是下调的分子,其靶基因的代谢通路均显著富集到Th1 and Th2 cell differentiation、Th17 cell differentiation、B cell receptor signaling pathway等与细胞分化相关的信号通路以及与肿瘤相关的信号通路上。结论在rEg.P29诱导下小鼠免疫细胞存在差异表达的microRNA分子,这些分子可能与免疫细胞的分化相关。

包虫病诊断抗原分子Eg-00512的筛选、重组表达及抗原性鉴定

目的筛选细粒棘球绦虫原头蚴抗原分子Eg-00512,并进行重组表达、纯化及免疫特性鉴定,以期作为棘球蚴病特异性诊断抗原。方法对国家人类基因组南方研究中心(CHGCS)发表的细粒棘球绦虫4个不同发育阶段的表达谱数据进行差异比较分析,筛选仅在原头蚴阶段特异表达的基因Eg-00512;利用DNAStar软件包对其编码蛋白Eg-00512进行抗原表位分析;选取合适的序列片段作为目的片段,构建基因工程菌株Eg-00512/pET-24a/BL-21,经诱导表达、纯化获得重组蛋白rEg-00512。将BALB/c小鼠随机分为免疫组、佐剂对照组、PBS对照组,分别经皮下多点注射重组蛋白、PBS+弗氏佐剂和PBS,2周后加强免疫一次。分别于免疫前,第一次免疫后2、4周每组小鼠尾静脉采血,免疫后5周摘眼球法采血,采用ELISA检测各时间点血清中特异性IgG抗体水平变化;以该血清为一抗,采用Western blot分析重组蛋白的免疫反应性。结果筛选出仅在细粒棘球蚴原头蚴阶段高表达的Eg-00512基因。该基因编码203个氨基酸,分子质量单位为23ku,其抗原表位主要位于1-15、55-93、111-119、126-149、166-194和199-202氨基酸残基及其附近。成功构建基因工程菌株Eg-00512/pET-24a/BL-21,经IPTG诱导表达重组蛋白rEg-00512。重组蛋白rEg-00512纯化后免疫小鼠诱导产生特异性IgG抗体,其中免疫5周时抗体达最高水平A450值为1.807±0.767,与佐剂对照组0.111±0.014和PBS对照组0.132±0.0246比较差异有统计学意义(P<0.01)。Western blot显示,该重组抗原可被免疫鼠抗血清及细粒棘球蚴原头蚴感染鼠血清识别,而不与正常小鼠血清反应。结论成功筛选并获得重组蛋白rEg-00512,该蛋白具有较好的抗原性,可作为棘球蚴病免疫诊断候选抗原。

重组蛋白P29对细粒棘球蚴感染小鼠肝脏组织TGF-β/Smad信号通路的影响

目的观察重组蛋白P29 (r P29)对细粒棘球蚴感染小鼠肝脏组织转化生长因子β(TGF-β)/Smad信号通路的作用。方法36只雌性BALB/c小鼠随机分为r P29免疫组(r P29组)、佐剂组、 PBS组,每组12只。r P29组小鼠皮下注射r P29蛋白(10μg/只,与等体积弗氏佐剂乳化),第2和4周各加强免疫1次;佐剂组、 PBS组仅注射相应的佐剂或PBS。末次免疫后2周, 3组小鼠均腹腔接种细粒棘球蚴原头节(1 500个/只)进行攻击感染。感染后12周,剖杀小鼠,分离肝脏组织,提取肝脏组织mRNA,实时荧光定量PCR检测小鼠肝脏组织中TGF-β1基因的相对表达水平,蛋白质印迹(Western blotting)检测小鼠肝脏组织中TGF-β/Smad信号通路下游相关蛋白TGFβ-RI、 TGFβ-RⅡ、 p-Smad2,3、 Smad4、 Smad7的表达水平。结果实时荧光定量PCR检测结果显示,佐剂组、 PBS组和r P29组小鼠肝脏组织中的TGF-β1 mRNA的相对表达量分别为0.98±0.42、 1.71±0.29和1.24±0.56, r P29组低于PBS组(P <0.01),高于佐剂组,但无统计学意义。Western blotting检测结果显示, r P29组小鼠肝脏组织TGF-β1蛋白表达灰度值为372.04±0.01,低于PBS组(673.02±0.06),高于佐剂组(213.69±0.31)。小鼠肝脏组织TGF-β/Smad信号通路相关蛋白的检测结果显示, r P29组TGF-β-RI、 TGF-β-RⅡ、 p-Smad 2,3、 Smad 4的灰度值分别为357.59±0.83、 289.07±0.21、 204.06±0.19、 396.11±0.01,低于PBS组(496.89±0.09、 378.41±0.01、428.11±0.29、 566.95±0.21),高于佐剂组(171.99±0.82、 185.77±0.09、 128.09±0.08、 205.87±0.59)。r P29免疫组Smad 7蛋白灰度值为278.89±0.12,高于PBS组(142.32±0.07),低于佐剂组(384.17±0.51)。结论r P29能够降低细粒棘球蚴感染小鼠肝脏组织中TGF-β1 mRNA和蛋白的表达水平;下调TGF-β/Smad下游信号通路相关蛋白TGF-β-RⅠ、 TGF-β-RⅡ、 p-Smad 2,3和Smad 4的表达,上调Smad 7的表达。

细粒棘球绦虫原头节抗原Eg-01883的B细胞表位预测、筛选及其血清学诊断价值

目的应用计算机软件分析细粒棘球绦虫原头节特异性抗原分子Eg-01883,预测其可能形成的B细胞表位,并探讨其B细胞表位的免疫反应性及诊断价值。方法使用在线软件SOPMA及DNAStar分析Eg-01883的二级结构,采用SWISS-Model预测该蛋白的三级结构。应用在线软件ABCPred和IEDB结合其亲水性、柔韧性、表面可及性、抗原性等二级结构和三级结构对其B细胞表位进行分析预测、并人工合成表位肽段;以完整蛋白rEg-01883免疫小鼠产生的抗血清为一抗,采用间接ELISA方法筛选免疫反应性较强的表位,然后再以感染细粒棘球绦虫的小鼠血清为一抗,ELISA检测其免疫反应性,评价其诊断价值。结果初步筛选出7条抗原指数较高的Eg-01883表位,B细胞表位区域位于1-15、19-34、155-169、180-196、216-232、236-248、271-287位氨基酸。合成上述表位,纯度为99.99%。使用完整蛋白免疫血清筛选出2条反应原性较强的优势表位19-34和180-196,细粒棘球蚴感染小鼠血清能识别这两条B细胞表位,A450值结果分别为0.8218±0.0406和0.6398±0.0447,与对照组A_(450)值0.3312±0.0267和0.2961±0.0284比较差异均有统计学意义(P<0.05)。结论成功筛选到两个潜在的B细胞表位诊断抗原肽,对进一步开发细粒棘球绦虫早期诊断抗原和研究优势表位疫苗具有重要意义。

细粒棘球绦虫重组亲肌肉抗原ZW-15免疫小鼠LncRNA 031520表达的研究

目的探讨长链非编码RNA031520(LncRNA 031520)分子在细粒棘球绦虫重组亲肌肉抗原ZW-15诱导小鼠免疫保护的表达分析。方法36只雌性BALB/c小鼠分为PBS对照组、弗氏佐剂组和ZW-15免疫组,12只/组。PBS对照组、弗氏佐剂组分别皮下多点注射PBS溶液和完全/不完全弗氏佐剂100μl/只,ZW-15免疫组注射重组抗原100μl/只(10μg/只)。弗氏佐剂组和ZW-15免疫组初次免疫使用完全弗氏佐剂,加强免疫使用不完全弗氏佐剂。共免疫3次,初次免疫后的2次加强免疫间隔时间为两周。免疫小鼠经麻醉取血,分离血清。采用ELISA法检测特异IgG、IgG1、IgG2a、IgG2b抗体水平。无菌取脾脏,分离淋巴细胞采用流式细胞术分选CD4^(+)T淋巴细胞、CD8^(+)T淋巴细胞及B淋巴细胞群;利用qRT-PCR检测CD4^(+)T淋巴细胞、CD8^(+)T淋巴细胞、B淋巴细胞及总淋巴细胞中LncRNA 031520及内参GAPDH的表达;利用流式细胞术检测脾脏CD4^(+)T淋巴细胞中IFN-γ、IL-4的表达。使用SPSS 17.0统计软件和Graphpad Prism 8.0绘图软件对实验数据进行统计分析。结果小鼠经亲肌肉重组抗原ZW-15免疫后血清特异IgG、IgG1、IgG2a及IgG2b抗体水平均升高,且均显著高于PBS组、弗氏佐剂对照组,差异均有统计学意义(P<0.001)。LncRNA 031520在ZW-15免疫组CD4^(+)T淋巴细胞、总淋巴细胞中相对表达量显著高于PBS对照组和弗氏佐剂对照组(P<0.01),在ZW-15免疫组B淋巴细胞及CD8^(+)T淋巴细胞中相对表达量与PBS对照组及弗氏佐剂对照组相比差异均无统计学意义(均P>0.05)。免疫组小鼠脾脏淋巴细胞Th1亚群标志分子IFN-γ表达量为(19.07±3.44)%,显著高于PBS对照组(8.03±2.67)%和弗氏佐剂对照组(9.37±1.25)%(P<0.05),Th2亚群标志分子IL-4表达量为(0.79±0.02)%,显著高于PBS对照组(0.44±0.13)%和弗氏佐剂对照组(0.50±0.15)%(P<0.05)。结论LncRNA 031520在细粒棘球绦虫重组亲肌肉抗原ZW-15免疫小鼠淋巴细胞中表达上调,可能在亲肌肉抗原抵御细粒棘球蚴感染中发挥免疫保护作用。

MTHFR基因检测对宝应地区育龄妇女围孕期叶酸服用的指导意义

探究宝应地区育龄妇女围孕期使用MTHFR基因检测对叶酸服用的指导意义。方法 于2017年8月对宝应地区育龄妇女进行随机抽样,对所有研究对象进行MTHFR基因检测与血浆同型半胱氨酸(HCY)水平检测,根究检测结果指导育龄妇女围孕期叶酸服用。结果 所选取调查对象中A1298C&C677T为A/C、C/C的有409人,占29.21%,A/A、C/C的有587人,占41.93%,其余404人均有不同程度上的叶酸代谢能力弱,占28.86%。补充叶酸后 Hcy显著比补充叶酸前低(P<0.05)。结论 MTHFR基因检测可指导宝应地区育龄妇女围孕期叶酸服用,并根据叶酸利用能力个体化补充叶酸,减少出生缺陷的发生率。