TRPC3对OIR小鼠视网膜和人视网膜血管内皮细胞生物学行为的调控作用

目的探讨瞬时受体电位阳离子通道亚家族C成员3(TRPC3)对氧诱导视网膜病变(OIR)小鼠视网膜和人视网膜血管内皮细胞(HREC)生物学行为的调控作用。方法选取健康SPF级7日龄C57BL/6小鼠32只,采用随机数字表法分为对照组和OIR组,每组16只,其中对照组不做特殊处理,OIR组小鼠诱导OIR模型。出生后第17天(PN17)采用视网膜铺片免疫荧光染色验证模型构建是否成功。将体外培养HREC分为正常对照组、转染试剂组和si-TRPC3组,其中正常对照组不做特殊处理,转染试剂组和si-TRPC3组分别采用转染试剂和转染试剂+si-TRPC3转染。采用实时荧光定量PCR法检测TRPC3 mRNA相对表达量;采用Western blot法检测TRPC3、转录因子NF-E2相关因子(Nrf2)和超氧化物歧化酶(SOD)蛋白相对表达量。另将HREC分为正常对照组、血管内皮生长因子(VEGF)组、si-TRPC3组和Pyr3(TRPC3通道抑制剂)组,分别用完全培养基、含有20 ng/ml VEGF重组蛋白的培养基、含有20 ng/ml VEGF重组蛋白的培养基(si-TRPC3转染72 h)和含有20 ng/ml VEGF重组蛋白+1μmol/L Pyr3的培养基培养48 h,采用细胞计数试剂盒8(CCK-8)检测HREC增生能力;分别采用细胞划痕实验和Transwell实验检测细胞横向和纵向迁移能力。结果PN17时OIR组小鼠视网膜出现病理性新生血管团簇强荧光染色。OIR组小鼠视网膜TRPC3 mRNA和蛋白相对表达量分别为2.057±0.244和1.517±0.290,明显高于对照组的0.983±0.033和0.874±0.052,差异均有统计学意义(t=6.165、3.094,均P<0.05)。si-TRPC3组TRPC3 mRNA和蛋白相对表达量明显低于正常对照组和转染试剂组,Nrf2和SOD蛋白相对表达量明显高于正常对照组和转染试剂组,差异均有统计学意义(均P<0.05)。CCK-8实验结果显示,VEGF组细胞吸光度(A)值明显高于正常对照组,si-TRPC3组和Pyr3组细胞A值明显低于VEGF组,差异均有统计学意义(均P<0.05)。细胞划痕实验结果显示,VEGF组细胞横向迁移率高于正常对照组,si-TRPC3组和Pyr3组细胞横向迁移率低于VEGF组,差异均有统计学意义(均P<0.05)。Transwell实验结果显示,VEGF组染色细胞数明显多于正常对照组,si-TRPC3组和Pyr3组染色细胞数明显少于VEGF组,差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论OIR模型小鼠视网膜中TRPC3表达水平升高,下调TRPC3可抑制HREC增生和迁移能力,其机制与Nrf2氧化应激通路激活有关。

高表达Krüppel样因子6对紫外线B诱导的人晶状体上皮细胞凋亡的影响

目的探讨Krüppel样因子6(KLF6)高表达对于紫外线B(UVB)诱导晶状体上皮细胞(HLECs)凋亡的影响。方法利用脂质体转染的方法将已成功构建的真核表达质粒pEGFP-C2-KLF6转染到HLECs中,采用Westernblot法测定细胞中KLF6蛋白的表达水平;采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测转染后细胞活力;经苏木精-伊红染色法观察细胞形态;采用Live/Dead染色法观察细胞受损情况;采用Westernblot法检测细胞中凋亡标志物bax和bcl-2的相对表达量,并计算bax/bcl-2比值;采用细胞凋亡检测试剂盒定量测定细胞凋亡水平,并检测细胞中活性氧簇(ROS)的表达水平。结果0.5μg转染组和1.0μg转染组细胞生存力较空载体对照组下降,差异均有统计学意义(均P<0.05)。KLF6高表达组细胞稀疏,细胞形态狭长,细胞质浓缩。正常对照组细胞形态稳定,数量均匀,为绿色活细胞;KLF6高表达组红色死亡细胞数量显著增多。UVB照射后,KLF6高表达组HLECs细胞凋亡值、bax相对表达量、bax/bcl-2比值、ROS表达量均高于空载体对照组,差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论高表达的KLF6通过调控凋亡相关蛋白的表达及促进内质网内ROS堆积来加剧UVB照射导致的HLECs凋亡,提示KLF6参与HLECs的凋亡调控。通过生物学手段特异性下调KLF6的表达有可能在一定程度上发挥对HLECs的保护作用。

色素上皮衍生因子受体在糖尿病视网膜病变发生发展中的作用和机制研究进展

内源性色素上皮衍生因子(PEDF)因其所具有的抗血管生成作用、抗炎作用和神经保护、神经营养作用展示出作为治疗糖尿病视网膜病变(DR)药物靶点的巨大潜力。PEDF通过与细胞膜表面的受体蛋白结合,调控多种信号通路从而发挥其生物学作用。低密度脂蛋白受体相关蛋白6发挥抑制DR氧化应激反应、炎症反应和新生血管的作用,脂肪三酰甘油脂肪酶、层粘连蛋白受体、丛状蛋白结构域(PLXDC)1、PLXDC2和F1-腺嘌呤核苷三磷酸合酶均具有促进内皮细胞凋亡的作用,其中PLXDC1还具有神经保护作用。通过明确PEDF所作用的受体,探究受体与PEDF的亲和能力、疾病过程中各受体表达水平的差异,以及PEDF与特定受体结合后所发挥的特定功能,能针对受体高亲和性的活性结构域开发融合蛋白类药物,对DR的发病机制进行更清晰的理解,以PEDF或PEDF受体为靶点,夯实DR新治疗药物与治疗方法研发的理论依据。

铁死亡参与糖尿病视网膜病变发病机制的研究进展

糖尿病视网膜病变(DR)是导致成年人失明的主要视网膜血管病之一。目前DR的治疗策略具有一定疗效但存在各种局限性,因此亟需深入探究DR的发病机制,探索新的治疗靶点。铁死亡是一种特殊的细胞程序性死亡方式,近些年来研究发现,铁死亡可以通过诱导视网膜氧化应激反应、引起视网膜血管异常改变、加剧视网膜神经损伤和导致免疫异常等方面参与DR的发生和发展。因此,探索铁死亡在DR中的作用机制可为铁死亡抑制剂作为潜在预防和治疗DR药物临床转化的可能性提供有力的基础科学依据,为DR的防治开辟新途径。

多聚嘧啶序列结合蛋白相关剪接因子对缺氧诱导人视网膜微血管内皮细胞功能的影响

目的观察多聚嘧啶序列结合蛋白相关剪接因子(PSF)对缺氧诱导的人视网膜微血管内皮细胞(hRMECs)功能的影响。方法采用三质粒系统构建慢病毒颗粒(LV)-PSF。LV-PSF体外感染hRMECs后通过流式细胞计数法测定其感染效率。应用实时定量PCR(RT-PCR)检测经LV-PSF感染的hRMECs中PSF mRNA表达水平。将实验分为体内和体外两部分。体内实验:7日龄健康C57B/L6小鼠20只,采用随机数字表法分为正常组、氧诱导视网膜病变(OIR)组、OIR+LV-空载体(Vec)组和OIR+LV-PSF组,每组5只。除正常组外,其余3组构建OIR模型。OIR组除缺氧刺激外,不做其余处理。OIR+LV-Vec组和OIR+LV-PSF组小鼠分别玻璃体腔注射LV-Vec或LV-PSF。观察LV-PSF对视网膜新生血管(RNV)形成的影响。体外实验:将hRMECs分为正常组、缺氧组、空载组、PSF高表达组。正常组为正常体外培养的hRMECs;缺氧组为缺氧刺激3 h恢复正常培养条件24 h的hRMECs;空载组、PSF高表达组分别为用LV-Vec、LV-PSF感染48 h,再用缺氧刺激3 h恢复正常培养条件24 h的hRMECs。采用MTT比色法观察PSF对细胞增生能力的影响。采用细胞划痕实验和Transwell迁移实验观察PSF对缺氧刺激下细胞迁移能力的影响。采用RT-PCR观察各组细胞中HIF-1α、VEGF及PSF的mRNA表达。结果成功构建可稳定高表达PSF的LV-PSF,流式细胞仪测定其感染效率为97%,RT-PCR测得经LV-PSF感染的hRMECs中PSF mRNA水平明显上调。体内实验:OIR组、OIR+LV-Vec组小鼠RNV面积较正常组明显增加(t=18.31、43.71),OIR+LV-PSF组小鼠RNV面积较OIR组(t=11.30)、OIR+LV-Vec组(t=15.47)明显减小,差异均有统计学意义(P<0.05)。体外实验:MTT比色法检测结果显示,缺氧组hRMECs增生能力较正常组明显增强(t=2.57),PSF高表达组hRMECs增生能力较正常组、缺氧组、空载组明显降低(t=5.26、5.46、3.73),差异均有统计学意义(P<0.05)。细胞划痕实验结果显示,缺氧刺激3 h恢复正常条件24 h或48 h均可刺激缺氧组与空载组细胞明显迁移(t=8.35、13.84,P<0.05);而与缺氧组与空载组比较,PSF高表达组细胞迁移不明显(t=10.99、18.27、9.75、8.93、26.94、7.01,P<0.05)。Transwell小室实验结果显示,正常组和空载组微孔膜上染色的细胞数较多,而PSF高表达组微孔膜上染色的细胞数明显减少(t=9.33、6.15,P<0.05)。RT-PCR检测结果显示,与正常组比较,缺氧组、空载组hRMECs中HIF-1α、VEGF的mRNA表达明显增加(t=15.23、21.09,P<0.05),PSF mRNA表达无明显变化(t=0.12、2.15,P<0.05);与缺氧组、空载组比较,PSF高表达组hRMECs中HIF-1α、VEGF的mRNA表达明显下降(t=10.18、13.10,P<0.05),PSF mRNA表达明显增加(t=65.00、85.79,P<0.05)。结论PSF可减少OIR模型小鼠RNV面积。PSF可能通过HIF-1α/VEGF信号通路抑制缺氧诱导的hRMECs增生和迁移。

聚嘧啶束结合蛋白相关剪接子高表达对糖基化终末产物诱导下人视网膜微血管内皮细胞氧化损伤的作用

目的观察探讨聚嘧啶束结合蛋白相关剪接子(PSF)高表达对糖基化终末产物(AGEs)诱导下人视网微血管内皮细胞(hRMECs)氧化损伤的保护作用及相应分子机制。方法将hRMECs分为正常组、空载组、PSF组、锌原卟啉(ZnPP)组及PSF+ZnPP组进行实验。正常组细胞使用含有10%胎牛血清、青霉素/链霉素的DMEM培养基,置于37°C、95%空气、5%CO2的密闭恒温培养箱中培养。空载组细胞采用空载慢病毒感染。PSF组细胞采用过表达PSF慢病毒感染。ZnPP组细胞采用ZnPP(10 mol/L)处理2 h。PSF+ZnPP组细胞采用过表达PSF慢病毒感染后,再用ZnPP(10 mol/L)预处理2 h。后四组细胞辅以AGEs刺激,HE、Hoechst33258染色法和流式细胞法观察PSF高表达对细胞损伤的保护作用以及ZnPP对PSF的拮抗作用。采用Western blot检测细胞中血红素氧合酶-1(HO-1)、磷酸化(p)细胞外调节蛋白激酶(ERK)、核因子2相关因子2(Nrf2)的蛋白表达。引入ERK通路的特异性拮抗剂U0126,Western blot验证U0126对PSF蛋白所诱导的HO-1表达的逆转作用。结果HE染色和Hoechst33258染色结果显示,PSF组受损细胞核数较正常组明显增加,较PSF+ZnPP组明显减少,差异均有统计学意义(F=27.5、38.7,P<0.05)。流式细胞法结果显示,PSF组细胞产生的ROS较正常组明显增加,较PSF+ZnPP组明显减少,差异有统计学意义(F=126.4,P<0.05)。Western blot检测结果显示,PSF组HO-1蛋白表达量较正常组、空载组明显增加,差异均有统计学意义(F=70.1,P<0.05);AGEs处理30、60、120、240 min时pERK的蛋白表达量与15 min时比较,差异均有统计学意义(F=474.0,P<0.05);PSF+/U0126-组HO-1、Nrf2蛋白表达量较PSF-/U0126-组明显增加,PSF+/U0126+组HO-1、Nrf2蛋白表达量较PSF+/U0126-组明显降低,差异有统计学意义(F=30.2、489.4,P<0.05)。结论PSF高表达可以通过活化ERK通路,促进Nrf2转位入核进而诱导HO-1表达,从而保护hRMECs免受AGEs诱导的氧化损伤。

富里酸干预缺氧诱导人视网膜微血管内皮细胞基因表达谱的MiSeq测序分析

目的观察富里酸(FA)干预缺氧诱导的人视网膜微血管内皮细胞(hRMEC)基因表达谱的MiSeq测序分析结果。方法体外培养hRMEC,并将其分为缺氧组(缺氧处理)和FA干预组(即缺氧后FA干预)。采用MTT比色法检测不同浓度和不同作用方式的FA对hRMEC活性的影响。选择FA的最佳作用浓度,通过实时荧光定量PCR(RT-PCR)验证FA对缺氧诱导hRMEC中细胞间黏附分子-1(ICAM-1)、IL-1β、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、MMP-2、TNF-α、TNF-β等炎症因子及炎症相关因子mRNA表达的影响。收集处于对数生长期的缺氧组和FA干预组细胞,应用MiSeq测序技术对两组细胞进行全转录组测序,获得生物学大数据,在此基础上分析差异表达的miRNA;通过基因注释(GO)功能显著性富集分析和京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路显著性富集分析对差异miRNA的功能及信号通路进行分析。组间炎症因子及炎症相关因子表达比较时,通过miRNA mimic调节细胞中相应miRNA的表达水平,观察其对细胞功能的影响,从而判断该miRNA的作用。结果不同浓度和不同作用方式的FA对hRMEC的细胞活性无影响。RT-PCT检测结果显示,缺氧组hRMEC中ICAM-1、IL-1β、IL-6和TNF-β的mRNA表达较正常组明显上调,差异有统计学意义(t=3.426、6.011、5.282、6.500,P=0.027、0.004、0.006、0.003);FA干预组hRMEC中ICAM-1、IL-6、TNF-α和TNF-β的mRNA表达较缺氧组明显下降,差异有统计学意义(t=9.961、3.676、3.613、3.387,P=0.001、0.021、0.023、0.028)。缺氧组和FA干预组之间共有14个差异表达miRNA,其中上调基因9个,下调基因5个。共4个差异miRNA(hsa-miR-1285-3p、hsa-miR-30d-3p、hsa-miR-3170、hsa-miR-7976)的预测靶基因均为ICAM-1。GO功能显著性富集分析结果显示,差异基因的功能主要富集在细胞发育、细胞分化和单生物发育过程中。KEGG通路显著性富集分析结果显示,差异miRNA表达高度富集的是癌症中蛋白多糖通路和细胞因子-细胞因子受体相互作用通路,差异表达较明显的是花生四烯酸代谢通路和安非他明成瘾性通路。结论FA可能通过调控多个miRNA的表达,影响下游ICAM-1 mRNA的表达水平,从而对缺氧刺激hRMEC后细胞的炎性状态产生影响。

慢病毒介导的微小RNA-191对小鼠视网膜新生血管的抑制作用

目的观察慢病毒介导(LV)的微小RNA (miR)-191对氧诱导视网膜病变(OIR)模型小鼠视网膜新生血管(RNV)的抑制作用。方法7日龄C57BL/6J小鼠80只,随机分为正常组、非干预组、LV miR-191 (LV-191)组、生理盐水(NS)组、LV-绿色荧光蛋白(GFP)组,每组均为16只。参照文献方法建立OIR小鼠模型。12日龄时,LV-191组、NS组、LV-GFP组,小鼠右眼玻璃体腔分别注射1 μl LV-191、NS、LV-GFP;正常组、非干预组小鼠不做处理。视网膜铺片观察视网膜无灌注区相对面积,病理切片计数突破内界膜的视网膜血管内皮细胞核数;实时定量PCR (RT-PCR)检测小鼠视网膜中LV-191、p21 mRNA相对表达量。结果正常组、非干预组、LV-191组、NS组、LV-GFP组小鼠视网膜无灌注区面积比较,差异有统计学意义(F=127.20,P<0.001);突破内界膜的血管内皮细胞核计数比较,差异有统计学意义(F=31.71 ,P<0.05)。RT-PCR检测结果显示,正常组、非干预组、LV-191组、NS组、LV-GFP组小鼠视网膜中miR-191、p21 mRNA相对表达量比较,差异有统计学意义(F=10.95、15.60,P<0.05、<0.05)。与正常组、非干预组、NS组、LV-GFP组小鼠比较,LV-191组视网膜中miR-191、p21 mRNA相对表达量均明显上调,差异有统计学意义(P<0.05)。结论慢病毒介导的miR-191可通过上调p21表达抑制RNV的生成。

miR-191抑制视网膜血管内皮细胞增生和血管形成

目的观察慢病毒(LV)介导miR-191对体外培养的人视网膜血管内皮细胞(hREC)增生和血管生成的抑制作用。方法体外培养hREC细胞系,分为对照组、缺氧组、LV-空载体(LV-vector)组、LV-miR-191(LV-191)组。LV-vector组、LV-191组分别转入相应的慢病毒载体。采用流式细胞仪检测细胞转染率;细胞计数试剂盒-8(CCK-8)实验检测细胞增生能力;划痕实验和侵袭小室(Transwell)实验检测细胞迁移能力;Matrigel实验检测细胞管腔形成能力;实时定量聚合酶链反应(qPCR)检测miR-191相对表达量及其下游靶基因p21、血管内皮生长因子(VEGF)、细胞分裂蛋白激酶(CDK)6、细胞周期蛋白-D1(Cyclin D1)mRNA相对表达量。两两比较采用独立样本t检验。结果流式细胞仪检测结果显示,对照组、LV-191组细胞转染率分别为0.615%、99.400%。CCK-8、细胞划痕、Transwell细胞迁移、Matrigel实验结果显示,与对照组比较,缺氧组、LV-vector组细胞增生数量明显增多(t=6.130、4.606)、细胞迁移率明显增高(t=4.910、6.702)、微孔膜上染色的细胞数量明显增多(t=7.244、6.724)、细胞管腔形成能力增强(t=8.345、9.859),LV-191组细胞增生数量明显减少(t=14.710)、细胞迁移率明显降低(t=6.245),微孔膜上染色的细胞数量明显减少(t=5.333)、细胞管腔形成能力明显减弱(t=5.892),差异均有统计学意义(P≤0.01)。qPCR检测结果显示,与对照组、LV-vector组比较,LV-191组细胞中miR-191 mRNA相对表达量明显上调(t=44.110、42.680),Cyclin D1(t=29.940、14.010)、CDK6(t=15.200、7.645)mRNA相对表达量明显下降,差异均有统计学意义(P<0.01);p21 mRNA相对表达量增高,但差异无统计学意义(t=2.013、2.755,P>0.05)。4组细胞中VEGF mRNA相对表达量比较,差异无统计学意义(F=0.966,P>0.05)。结论miR-191可通过上调p21 mRNA表达,下调CDK6、Cyclin D1 mRNA表达,抑制hREC增生、迁移及管腔形成。

糖尿病视网膜病变动物模型选择和应用的研究进展

根据诱导糖尿病视网膜病变(DR)的实验方法不同以及观察到的视网膜病变特点不同,DR动物模型可分为药物或食物诱发性模型、氧诱导视网膜病变(OIR)模型、自发遗传性模型和基因模型。诱发性模型是目前最常用于DR研究的动物模型,具有耗时短、成本低、方法简便、重复性较好和短期内可批量造模等优点;但其使用的药物对实验动物的全身各器官均有一定的毒副作用,动物死亡风险较大。OIR模型的表型重复性高、稳定性高且成本相对较低,但由于OIR小鼠缺乏全身性高血糖的代谢改变,此模型无法准确反映高血糖状态下由于代谢情况对视网膜病变的影响。自发遗传性模型病理改变较为稳定,但由于价格昂贵,且同系繁殖和单基因遗传会使其糖尿病的遗传同质性与人类有差异,限制了该模型的广泛应用。基因模型的优点是病因明确,但对技术、实验操作和实验仪器要求高,成本高不适合大批量造模,因此在应用中受限。研究者应从特定的研究目的、观察指标、实验条件和经费等多方面综合考量,结合DR模型的特点和局限性,从而选择最佳的动物模型。此外,仍需开发能够更精确模拟DR的动物模型,以扩展对DR机制的探索,为研发可行的预防和治疗方法提供更加有效的工具。