36型人腺病毒腺病毒基因早期转录区4可读框基因1(E4ORF1)的原核表达及多克隆抗体制备

目的利用分子克隆技术构建36型腺病毒(Ad36)腺病毒基因早期转录区4可读框基因1(E4ORF1)重组原核表达质粒pET30a-E4ORF1,经诱导表达后,制备并纯化获得E4ORF1抗原,经免疫兔后获得多克隆抗体。方法根据NCBI数据库中人Ad36基因组全序列,设计引物、PCR扩增其中的E4ORF1基因全长并将其克隆至原核表达载体中、测序。将测序正确的原核表达质粒pET30a-E4ORF1转化至E.coliBL21(DE3)菌株中,通过探索E4ORF1蛋白的最佳诱导条件后,对重组蛋白进行大量诱导表达和纯化。将纯化获得的重组蛋白免疫新西兰白兔,在5次免疫后分离血清,ELISA检测抗体效价。抗原亲和纯化出E4ORF1多克隆抗体,Western blot法检测抗体的特异性。结果成功扩增E4ORF1基因,经测序比对与GenBank序列一致,大小为408 bp,证明成功构建原核重组表达质粒。经鉴定重组蛋白的相对分子质量(M_(r))约14000,ELISA检测5次免疫后兔血清抗体效价达1∶320000。Western blot法证明该抗体具较高的特异性。结论成功表达E4ORF1蛋白,并制备了高特异性的兔抗E4ORF1多克隆抗体。

人腺病毒36型在3T3-L1脂肪细胞棕色化过程中的作用

目的探讨人腺病毒36型(Ad36)在诱导3T3-L1脂肪细胞棕色化过程中的作用。方法(1)采用经典的鸡尾酒诱导法(MDI)将3T3-L1前脂肪细胞定向成脂诱导分化至第4天,然后将已经分化的3T3-L1脂肪细胞分为MDI组、MDI+Rapa组、MDI+Ad36组以及MDI+Rapa+Ad36组,并将继续分化至第8天的细胞行氟化硼二吡咯染色,观察细胞内脂滴大小与成脂情况;(2)实时荧光定量PCR检测4组细胞中棕色脂肪标记基因过氧化物酶体增殖物活化受体共激活因子1α(pgc1α)、解偶联蛋白1(ucp1)、成纤维生长因子21(fgf21),线粒体相关酶基因atp5o、cox5b、nd2 mRNA表达水平;(3)Western blot分别检测上述基因蛋白质表达水平。结果(1)在3T3-L1脂肪细胞分化的第8天,MDI与MDI+Rapa组细胞内均出现较多且大的脂滴;与MDI组相比,MDI+Ad36组脂滴减小;与MDI+Ad36组相比,MDI+Ad36+Rapa组脂滴略有增大。(2)与MDI组相比,MDI+Ad36组棕色脂肪标记基因pgc1α、ucp1、fgf21,线粒体相关酶基因atp5o、cox5b、nd2基因mRNA表达水平显著升高,在加入Rapa后,上述基因mRNA表达水平显著降低,差异均具有统计学意义(P<0.05)。(3)与MDI组相比,MDI+Ad36组PGC1α、UCP1、FGF21、ATP5O、COX5B、ND2以及磷酸化mTOR蛋白质表达水平均显著升高(P<0.05),在加入Rapa后,上述蛋白质表达水平均显著降低,差异均具有统计学意义(P<0.05)。结论 Ad36可能通过mTOR上调pgc1α的表达,并进一步使ucp1、fgf21、atp5o、cox5b、nd2的基因表达水平升高,加快甘油三酯的分解与线粒体氧化磷酸化,使3T3-L1脂肪细胞棕色化。

Ad36诱导3T3-L1细胞棕色化的作用研究

目的探讨腺病毒36型(Ad36)在诱导3T3-L1细胞棕色化过程中的作用。方法对鸡尾酒法诱导组(对照组)和鸡尾酒加Ad36诱导组(实验组)第0、2、4、6、8天3T3-L1细胞进行BODIPY染色,观察细胞成脂情况;实时荧光定量PCR和免疫印迹法检测2组解耦联蛋白1(Ucp1)、ATP合成酶O亚基(Atp5o)、细胞色素c氧化酶亚基5B(Cox5b)、周脂素(Perilipin)的mRNA与蛋白表达水平。结果BODIPY染色结果显示,随着诱导天数的增加,对照组脂肪细胞内脂滴呈现出由小到大的动态变化,而实验组细胞内脂滴先增大,在第4天加入Ad36后脂滴变小。与对照组相比,实验组Ucp1、Atp5o、Cox5b mRNA和蛋白表达水平显著升高,Perilipin mRNA和蛋白表达水平则明显下降(P<0.05)。结论在3T3-L1细胞分化过程中,Ad36通过正向调控Ucp1、Atp5o、Cox5b基因表达促进3T3-L1细胞棕色化。

Ad36诱导分化的脂肪细胞中LncRNA00602的作用初探

目的探讨腺病毒36型(Ad36)诱导分化的脂肪细胞中,长链非编码RNA(LncRNA)00602促进棕色化的可能作用。方法根据Ad36感染与否,将肥胖患者分为Ad36阴性组和Ad36感染组。利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测2组患者网膜脂肪组织中LncRNA00602 mRNA表达水平变化,并分析其与同组患者腰臀比、收缩压、舒张压、空腹血糖、三酰甘油等指标的相关性。采用HE染色检测Ad36阴性组和Ad36感染组网膜脂肪组织中脂肪细胞大小,qRT-PCR及Western印迹法检测2组患者网膜脂肪组织中解偶联蛋白1(UCP1)、PR结构域蛋白16(PRDM16)的mRNA及蛋白质表达水平。分离、培养人脂肪源性干细胞(hADSC),利用Ad36诱导hADSC分化,并分为对照组和LncRNA00602敲低组,在敲低LncRNA00602后第0、2、4天,采用氟硼二吡咯(BODIPY)及线粒体红色荧光(Mito-Tracker Red)分别对细胞内脂滴和线粒体进行荧光染色,同时用qRT-PCR及Western印迹法检测UCP1、PRDM16表达水平的变化。结果Ad36感染组中LncRNA00602基因表达水平高于Ad36阴性组(均P<0.05),Ad36阴性组中LncRNA00602表达水平与以上临床指标相关性无统计学意义,而Ad36感染组LncRNA00602表达水平与血清空腹血糖、三酰甘油呈负相关(r分别为-0.522、-0.486,P<0.05);HE染色显示,Ad36感染组平均脂肪细胞面积小于Ad36阴性组,同时UCP1、PRDM16基因表达水平均高于阴性组(均P<0.05)。在细胞水平,敲低LncRNA00602后第2、4天,LncRNA00602敲低组脂肪细胞的脂滴面积大于对照组,同时线粒体数量较对照组减少,差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01);与对照组相比,LncRNA00602敲低组脂肪细胞棕色化标志基因UCP1、PRDM16 mRNA和蛋白质表达水平均显著降低(均P<0.05)。结论Ad36诱导的脂肪细胞分化中,LncRNA00602可能正向调控了UCP1、PRDM16的表达和脂滴的代谢变化,并引起脂肪细胞棕色化的发生。