高效表达干扰素α1b(IFN-α1b)工程菌的高密度发酵及干扰素纯化

目的在构建高效表达IFN-α1b重组大肠杆菌工程菌的基础上,建立适合该工程菌的发酵和纯化工艺.方法采用高密度培养方法(HCDC)和柱层析纯化技术.结果发酵密度A600可达70,表达量为菌体总蛋白的30%左右.经破菌、离心、离子交换和分子筛凝胶过滤得到IFN-α1b纯品,FPLC测定纯度为100%,活性为4.99×107U/ml,比活为2.5×107U/mg,均符合2000版<中国生物制品规程>要求.结论已建立了适用于规模化生产的发酵纯化工艺.

乙型脑炎病毒SA_(14)-14-2减毒疫苗株的生物学和基因稳定性

目的研究乙型脑炎病毒(JEV)SA14-14-2减毒疫苗株传代过程中的生物学和基因稳定性,为疫苗的安全性和免疫原性提供依据。方法将JEVSA14-14-2减毒疫苗株PHKC7代病毒在原代地鼠肾细胞(PHKC)上连续传代,检测各代次病毒的培养特性以及第8、12、17和22代病毒的安全性及免疫原性;对起止代次病毒(PHKC8和22代)进行全基因组序列测定,对中间代次病毒(PHKC12和17代)的结构蛋白基因进行测序,并与基因库乙脑病毒SA14-14-2株(D90195)比较。结果各代次病毒产生的细胞病变基本一致,病毒滴度在17代前较稳定;在BHK21细胞上形成的蚀斑形态一致;小鼠脑内的致病力未发生变化,乳鼠传代返祖试验高代次病毒毒力有升高趋势。8、12、17和22代病毒免疫小鼠后,对P3强毒攻击均具有保护作用。E蛋白核苷酸和氨基酸序列,PHKC8代与D90195完全一致;而PHKC12、17和22代出现单个碱基(第2142或2143位)突变,导致E389氨基酸改变(D→N或D→A),但并非回复突变。4个代次病毒的PrM-C区结构蛋白基因均未发生变化。PHKC8、22代病毒的其他核苷酸突变发生在基因组非结构蛋白区和3′端非编码区;全序列PHKC8和22代与D90195比较,发现7～8个核苷酸不同,导致3～4个氨基酸的差异,核苷酸和氨基酸的同源性分别大于99.93%和99.88%,且以上突变不存在于明确的相关减毒位点上。结论JEVSA14-14-2减毒疫苗株在PHKC上连续传15代,仍保持高度的生物学和基因稳定性,疫苗生产用病毒控制在10代以内较为安全。

采用可溶性噻唑盐WST-8检测细胞病变

目的 建立一种简便和客观的检测细胞病变的方法。方法 活细胞代谢过程中 ,可溶性噻唑盐WST 8在电子载体 1 MethoxyPMS存在时被还原形成的可溶性甲染料 ,通过读取A4 50 6 30 间接检测活细胞的个数 ,可用于细胞病变的检测。将WST 8法用于rhIFN α1b效价的检测 ,并与结晶紫法和常规镜检相比较。结果 相关性研究表明在一定细胞浓度范围内 (2 0 0～ 5 5 0 0 0细胞 孔 )Wish活细胞个数与A4 50 6 30 值呈线性相关 ,相关系数为 0 998。WST 8法检测rhIFN α1b的效价结果与结晶紫法和常规镜检结果基本一致 ,相关系数分别为 0 911(P <0 0 0 1)和0 94 5 (P <0 0 1)。结论 WST

聚乙二醇修饰重组人干扰素-α1b条件的优化

目的对聚乙二醇(PEG)衍生物化学修饰重组人干扰素-α1b(rhIFN-α1b)的条件进行优化。方法以3种不同的第2代PEG衍生物对rhIFN-α1b进行修饰,SDS-PAGE分析PEG及修饰产物的表观相对分子质量。对反应pH值、温度、时间、修饰剂用量等修饰条件进行优化,并对修饰产物进行初步分离纯化和活性检测。结果PEG的电泳表观相对分子质量大于其理论值;PEG20000的修饰率(92.1%)高于PEG5000和PEG10000;修饰剂用量和pH值是主要影响因素,最佳pH为9.0,rhIFN-αlb与PEG20000的最佳摩尔比为1∶10,时间和温度影响甚微。单点修饰产物保留了14.4%的体外活性,多点修饰产物无活性。结论选择了合适的PEG衍生物并优化了修饰条件,为进一步深入研究奠定了基础。

中国幽门螺杆菌cagA克隆和基因序列分析

目的 了解和分析中国幽门螺杆菌（ Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ， Ｈｐ）菌株细胞毒素相关基因Ａ（ｃａｇＡ） 的核苷酸序列特性．方法 从两位患胃溃疡儿童的胃粘膜中分离两株 Ｈｐ 菌株，用ＰＣＲ方法扩增ｃａｇＡ 基因的５○端和３○端的两个片段并作克隆和序列分析．结果 两株中国 Ｈｐ 菌株ｃａｇＡ 基因之间的同源性为９４ ％ ～９５ ％ ． 中国Ｈｐ 菌株与国外菌株相同区段比较，５○端的同源性为８９ ％ ～９２ ％ ，３○端的同源性为６９ ％ ．结论 中国Ｈｐ 菌株与国外Ｈｐ 菌株ｃａｇＡ 基因５○端序列部分区域的同源性较好，可以作为分子检测 Ｈｐ 感染的靶基因序列，而ｃａｇＡ 基因３○端序列部分区域的同源性较差，可以作为Ｈｐ 分子流行病学研究的靶基因序列．

应用等位基因特异性扩增法快速检测结核分支杆菌对利福平的耐药性

目的 建立一套等位基因特异性扩增 (ASA)的检测体系 ,用于结核分支杆菌对利福平耐药性的快速检测。方法 根据结核分支杆菌野生型基因设计ASA特异性引物 ,ASAPCR扩增 39株结核杆菌利福平耐药株的rpoB基因 ,经琼脂糖凝胶电泳检测 ,进而推断利福平的耐药性 ;同时进行DNA序列测定以验证ASA法的检测结果 ,并分析上海地区结核杆菌rpoB基因的突变特点。结果 在 39株利福平耐药株中共检出 36株 ,敏感性为92 3% ;与DNA测序结果的符合率为 87.2 % ,并鉴定了 11种不同类型的 4 1种突变形式 ,其中包括 9种点突变和 2种基因缺失。结论 用等位基因特异性扩增法分析结核分支杆菌的rpoB基因突变具有较高的特异性与敏感性。该法快速、简便、可靠 ,可应用于临床利福平耐药性的检测。

甲醇酵母分泌表达重组人干扰素α1b纯化工艺的建立

建立适合大规模、低成本生产重组人干扰素α1b(Recombinanthumaninterferon α1b ,rhIFN α1b)的纯化工艺。采用高效分泌表达rhIFN α1b的甲醇酵母工程菌发酵 ,收集离心后的上清液 ,超滤脱盐 ,经离子交换柱和分子筛柱层析纯化。纯化的rhIFN α1b的纯度为 98%以上 ,比活性 2 .4× 10 7IU/mg ,活性回收率 14 % ,相对分子质量 1980 0和等电点 5 .0。经检测 ,rhIFN α1b蛋白N 端 15个氨基酸序列与正常对照完全符合。该纯化工艺简便 ,时程短 ,重复性好 。

百日咳毒素S1亚单位截短片段的表达、纯化及初步应用

目的表达并纯化百日咳毒素(PT)S1亚单位截短片段S146,以其制备抗体,初步建立检测PT的双抗体夹心ELISA法。方法PCR扩增S146基因,亚克隆至载体pUC18,鉴定正确后,插入表达载体pET16b,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达产物经SDS-PAGE和Western blot鉴定后,用镍离子亲和层析柱纯化,复性后的蛋白免疫家兔,制备抗血清,纯化后作为包被抗体,建立检测PT的双抗体夹心ELISA法,并检测其特异性。结果表达的重组蛋白相对分子质量约为19000,主要存在于破菌沉淀中,表达量占菌体总蛋白的44%;纯化后蛋白纯度为94.5%;家兔抗血清可特异性识别天然PTSI;建立的双抗体夹心ELISA法特异性良好。结论已成功表达、纯化了PTS1亚单位截短片段S146,并以纯化的抗S146抗体作为包被抗体,初步建立了检测PT的双抗体夹心ELISA法,为研制特异性检测试剂和提供一种疫苗的质量控制方法奠定了基础。

NY-ESO-1／HSP65融合蛋白腹腔免疫小鼠的免疫效果

目的观察NYESO-1／热休克蛋白65（heat shock protein 65，HSP65）融合蛋白（NVH）免疫BALB／c小鼠诱导的体液和细胞免疫应答及其抗肿瘤作用。方法将BALB／c小鼠按简单随机方法分组，分别用NVH、NY-ESO-1与HSP65混合（NY＋H）、NY-ESO-1、HSP65和PBS腹腔免疫4次，间隔2周。每次免疫后第14天，对小鼠尾静脉采血，检测血清抗体滴度。末次免疫后第7天，取小鼠脾细胞，检测细胞因子、淋巴细胞增殖水平、CD4^＋和CD8^＋T细胞的百分比及对肿瘤细胞的特异性杀伤作用，采用t检验或χ^2检验对结果进行比较。结果NY-H组小鼠在第1次免疫后就产生了较高水平的抗体（吸光度值为0．841±0．059），与NY＋H组（0．333±0．077）和Ny-ESO-1组（0．275±0．183）相比差异有统计学意义（t=12．753，P〈0．01；t=7．204，P〈0．01）。NY-H组小鼠的IL-2和IFN-γ分泌能力均高于其他各组，并且CD4^＋、CD8^＋T细胞数量大幅增高，细胞增殖率（38.00％±3．84％）明显高于NY＋H组（12．90％±0．65％）和NY—ES（〉1组（10．90％±1.44％）（χ^2=830．1，P〈0．01；χ^2=994．0，P〈0．01）。小鼠免疫NY-H后，脾淋巴细胞能特异性杀伤表达NY-ESO-1的小鼠B16肿瘤细胞。结论NY-H能诱导小鼠产生较强的体液和细胞免疫应答，且具有良好的抗肿瘤作用。

卡介苗生产用菌株的遗传稳定性研究

目的观察我国生产用卡介苗上海D2PB302菌株(以下简称卡介苗上海D2株)的遗传稳定性。方法提取卡介苗上海D2株工作种子批4、7、10、13、15代单批培养物基因组DNA,以其为模板,PCR扩增16S核糖体RNA(16S ribosomal RNA,16S rRNA)基因,并进行测序鉴定;对卡介苗上海D2株缺失区RD1、RD2、RD8、RD14、RD16及双组分系统操纵子SenX3-RegX3串联重复序列进行多重PCR检测;对卡介苗上海D2株缺失区RD1及Esat6基因进行多重PCR检测;并对基因座SenX3-RegX3进行序列分析。结果卡介苗上海D2株工作种子批4、7、10、13、15代单批培养物的16S rRNA序列均未发生变异,与GenBank中登录的Pasteur 1173P2株序列(AM408590.1)相似性为100%;卡介苗上海D2株工作种子批各代次特征性凝胶电泳图谱显示条带位置均相同,其基因座SenX3-RegX3有3个串联重复序列,每个串联重复序列均以ATG起始,TG结尾,且前后重叠连接在一起;卡介苗上海D2株工作种子批各代次中均缺少编码毒力的Esat6基因。结论卡介苗上海D2株与国际常用卡介菌亚株相比具有其特征性的遗传学特性,在传代15代次以内,分子遗传学特性稳定。在《中国药典》三部(2010版)规定的12代次内制备疫苗,卡介苗遗传特性一致。

金黄色葡萄球菌α-溶血素及其突变体的原核表达和免疫学活性

目的原核表达金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,S.aureus)α-溶血素(α-hemolysin,Hla)及其突变体,并检测其免疫学活性。方法采用PCR法从S.aureus中扩增hla基因,将该基因克隆至原核表达载体p ET28a中,构建重组表达质粒p ET28a-hla,并利用点突变试剂盒进行突变,获得重组质粒p ET28a-hlaH35L。将两种重组表达质粒转化大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导表达;表达的重组蛋白经Ni-NTA亲和层析和CM离子交换层析纯化后,检测其溶血活性、免疫血清的抑制溶血活性及HlaH35L蛋白的免疫保护作用。结果重组表达质粒p ET28a-hla经双酶切和测序证明构建正确;重组质粒p ET28a-hlaH35L的测序结果显示,第35位氨基酸突变位点与设计相符。表达的Hla和HlaH35L蛋白相对分子质量约为36 000,均为可溶性表达,表达量约占菌体总蛋白的50%,纯化后纯度均在90%以上。Hla具有溶血活性,溶血比活为152 HU/mg;HlaH35L无溶血活性;抗Hla和抗HlaH35L血清均具有抑制Hla溶血的活性;在小鼠滴鼻攻击模型中,HlaH35L具有一定的保护作用。结论成功在大肠埃希菌中表达了具有良好免疫学活性的Hla及其突变体HlaH35L,为筛选S.aureus候选疫苗组分奠定了实验基础。

TRAIL_(114～281)-IL-24融合蛋白的原核表达及其体外抗肿瘤细胞活性

目的原核表达肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factor,TNF)相关的凋亡诱导配体(TNF-related apoptosis inducing ligand,TRAIL)114～281肽和人白细胞介素-24(Interleukin-24,IL-24)融合蛋白,并检测其体外抗肿瘤细胞活性。方法以人外周血单个核细胞总RNA为模板,PCR扩增TRAIL114～281和IL-24基因,经T4DNA连接酶连接成融合基因,克隆至pET-28a载体中,构建重组原核表达质粒pET-28a/TRAIL114～281-IL-24,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达的重组蛋白TI经层析法纯化后,进行Western blot分析,并采用MTT法检测其对肿瘤细胞增殖的影响,caspase3活性检测试剂盒检测其对不同肿瘤细胞caspase3活性的影响。结果重组表达质粒经酶切鉴定及测序证明构建正确;TI融合蛋白以包涵体形式表达,表达量约占菌体总蛋白的30%;纯化的重组蛋白纯度可达95%,且可与鼠抗人IL-24抗体发生特异性反应;经复性的蛋白能明显抑制人宫颈癌上皮细胞HeLa和人乳腺癌细胞MCF-7增殖,并显著提高肿瘤细胞的caspase3活性。结论已在大肠杆菌中表达了TRAIL114～281-IL-24融合蛋白,其具有诱导部分肿瘤细胞凋亡的活性。

S_(79)株流行性腮腺炎病毒不同代次的序列研究

目的观察流行性腮腺炎(腮腺炎)病毒(MuV)S79株各代病毒的蛋白基因在传代过程中是否发生变化,对比S79株主代病毒(S79-1-3)、蚀斑纯化病毒(S79-1-P7-3③)及ME(Enders株)病毒的基因差异。方法S79株主代病毒及蚀斑纯化病毒在原代鸡胚细胞(CEC)上连续传递12代,观察每代病毒培养特性及高变区SH基因序列,又选择其中的CEC5、6、10、15代,以及在鸡胚尿囊腔中传代的ME株病毒,测定各个主要基因序列(N、NS1/P、M、F及HN基因),对核苷酸序列和它相应的氨基酸序列以及基因差异进行计算机分析。结果S79株主代病毒及其蚀斑纯化病毒在CEC上连续传递12代,其培养特性、致细胞病变(CPE)及病毒滴度基本稳定。S79株主代病毒及其蚀斑纯化病毒与ME株病毒同属A基因型。S79株疫苗各个代次之间高变区SH基因未见突变。S79株的5、6、10、15代病毒在各个主要基因区域有散在基因的有意义突变比例极低。S79-1-3中不同亚株之间的比例可能会随传代而发生变化,比较认为经过蚀斑纯化的S79-1-P7-3③株在传代中较S79-1-3株更为稳定。结论S79株病毒与文献报道的JL2株十分相似,经连续传代总体的核苷酸差异<0.5%。S79-1-3主代病毒在药典规定代次范围内甚为稳定。经纯化的各代S79病毒则更为稳定,从分子水平上提示其在CEC15代内都可作为工作代毒种使用。

脑膜炎球菌表面蛋白fHBP与PorA的融合表达及其免疫原性

目的构建脑膜炎球菌（Neisseria meningitidis,Nm）表面蛋白fHBP重组表达质粒,并与PorA蛋白融合表达,对单抗原fHBP和融合抗原fHBP-PorA的免疫原性进行检测。方法筛选并优化fHBP和PorA基因序列,设计连接片段将PorA连接至fHBPC-端,构建重组表达质粒pET-24b-fHBP和pET-24b-fHBP-PorA,分别转化E.coli BL21（DE3）感受态细胞,IPTG诱导表达。表达的重组蛋白经镍柱亲和层析和凝胶过滤层析后免疫家兔,制备抗血清,采用间接ELISA、流式细胞术和微量血清杀菌力试验（serum bactericidal assay,SBA）评价抗原的免疫原性。结果经双酶切和测序鉴定,两个蛋白的重组表达质粒构建正确。重组蛋白fHBP以可溶形式表达,fHBP-PorA以包涵体形式表达,纯化后纯度均在90%以上。抗血清滴度均在1.0×10~5以上。流式细胞术检测显示,抗血清与Nm可发生特异性结合,且fHBP-Por A抗血清显示出一定的交叉反应。fHBP和fHBP-PorA抗血清对Nm29019的杀菌滴度为1∶128。结论 fHBP具有较好的抗原性和免疫原性,具备B群脑膜炎疫苗开发前景。多抗原融合策略需更多的优化考虑。

沪_(191)麻疹病毒疫苗株的核蛋白基因分析

目的研究沪191(S191)麻疹病毒疫苗株的核蛋白(N)基因.方法将S191株主代病毒(HK33HAM39CEC20)在实验室连续传递11代,从原代鸡胚细胞(CEC)20代连续传至CEC31代.除观察每代病毒培养特性外,还选其中的21、22、25、26、29、30、31代病毒及S191强毒株(HK33HAM45)、Edmonston(Ed)强毒株(HK28HAM40MRC-55),以逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术对这些病毒标本的N基因编码区的全长以及羧基末端的450个核苷酸区域进行片段扩增.结果通过N基因的序列分析发现,S191疫苗株与强毒株在N基因上有10～13个核苷酸差异,差异率为0.63%～0.82%.S191株主代病毒在CEC上连续传递11代的过程中,有2个代次病毒的个别核苷酸出现有义突变,分别导致第22代病毒的278位氨基酸Glu→Lys,第26代病毒的341位氨基酸Val→Lys,但这一变化不存在重复性,随着继续传代又恢复到21代的序列水平.结论S191麻疹病毒疫苗株在CEC长期传代过程中,各代次之间的N基因高变区序列一致,包括N基因中与免疫功能有关的3个B细胞表位区域的序列在传代中也无改变,故不可能影响到疫苗的免疫效果.

重组耻垢分枝杆菌NY-ESO-1疫苗的制备及其免疫原性分析

目的制备重组耻垢分枝杆菌(recombinant Mycobacterium smegmatis,rM.smegmatis)NY-ESO-1疫苗,并分析其在小鼠体内的免疫原性。方法从人睾丸m RNA中扩增NY-ESO-1基因,克隆至携带β半乳糖苷酶信号肽的表达载体,转化M.smegmatis,构建r M.smegmatis。以rM.smegmatis经腹腔免疫小鼠,200μl/只,于第12周用NY-ESO-1加强免疫1次,第3、6、9、12、13周经尾静脉采血1次,分离血清,并于第13周取小鼠脾脏,制备脾淋巴细胞,检测小鼠血清中NY-ESO-1抗体及其亚型、CD4^+、CD8^+T细胞比例、脾细胞增殖能力、IFNγ及IL-2的分泌水平及体外CTL杀伤能力。结果加强免疫后,与NY-ESO-1组比较,rM.smegmatis-p LA71NY组小鼠血清抗体水平差异无统计学意义(P>0.05),CD4~^+及CD8^+T细胞比例、IFNγ及IL-2的分泌水平及体外CTL杀伤能力均显著升高(P<0.05),脾细胞的增殖能力显著下降(P<0.05)。结论 rM.smegmatis NY-ESO-1疫苗在小鼠体内具有良好的免疫原性,为该疫苗用于肿瘤的免疫治疗奠定了基础。

一种奈瑟菌黏附素A的突变基因序列

脑膜炎球菌（Neisseria meningitidis,Nm）能导致流行性脑膜炎和暴发性败血症.全球每年流行性脑膜炎发病人数达30万～50万,成为重要的公共卫生问题之一.Nm可以分为13个血清群,主要致病群是A、C、Y、W135和B群.在欧美国家、新西兰等地,B群脑膜炎球菌已成为主要的致病菌群,占病例数的1/3 ～2/3以上.在我国,据中国疾病预防控制中心报告,2005-2009年在31个省、市、自治区中,已有25个分离到B群菌株.由于B群荚膜多糖与人体抗原之间存在交叉反应表位,其表面的优势蛋白具有复杂的表型,因此,疫苗开发难度很大,仅有少数几个外膜囊泡疫苗用于预防特定的疫苗特异性亚型菌株感染.

重组人IL-24的表达及其体外抗肿瘤细胞活性的研究

目的构建重组人白细胞介素24（recombinant human interleukin24，rhIL-24）表达载体并在大肠杆菌中表达，体外评估rhIL-24的生物学活性。方法用基因工程方法构建rhIL-24表达载体并在大肠杆菌中表达rhIL-24。表达的重组蛋白经层析法纯化后，分别用噻唑蓝比色法和蛋白印迹法检测rhIL-24对肿瘤细胞生长的影响和对内源性IL-24的诱导，用实时PCR检测不同肿瘤细胞与rhIL-24共孵育后细胞内的胱天蛋白酶3（caspase3）mRNA变化。结果rhIL-24能在大肠杆菌中高效表达，并能明显抑制多种肿瘤细胞生长。rhIL-24能诱导正常MRC-5细胞和多种肿瘤细胞产生内源性IL-24，并能改变肿瘤细胞的胱天蛋白酶3水平。结论rhIL-24能在大肠杆菌中高效表达，且具有生物学活性。

靶向人表皮生长因子受体3治疗性单克隆抗体的制备及筛选

目的制备并筛选靶向人表皮生长因子受体3(human epidermal growth factor receptor 3,Her3)的单克隆抗体。方法用CHO系统克隆表达Her3的胞外区,获得重组蛋白h GH-Her3-ECD,用该重组蛋白免疫BALB/c小鼠,并经常规细胞融合杂交瘤技术制备单克隆抗体。对制备的单克隆抗体进行抑制Her3与其配体HRG的结合试验、亲和力测定、亚型鉴定、结合抗原结构域的确定、识别肿瘤细胞表面Her3抗原的FACS分析及对A431细胞增殖抑制分析。结果获得100多株靶向Her3的单克隆抗体,其中927、1002、1050、993、1044、1056株具有较强的抑制Her3与HRG结合活性,均为Ig G1型,亲和力较好。927、1002、1050株与Her3第Ⅰ结构域结合,993、1044、1056株与Her3第Ⅲ结构域结合,均能结合A431和Bx Pc3表面的Her3分子,可明显抑制A431细胞的增殖。结论获得的靶向Her3单克隆抗体基本满足开发治疗性单抗的要求,具有成为治疗性单克隆抗体的潜在条件。