人CYP39A1基因过表达慢病毒载体构建及其在HepG2中表达

[目的]构建人CYP39A1基因过表达慢病毒载体,并建立CYP39A1基因过表达的HepG2细胞株,为研究CYP39A1在肝细胞肝癌中的作用机制奠定基础。[方法]构建具有嘌呤霉素抗性的CYP39A1慢病毒载体,经酶切鉴定及DNA测序鉴定后,包装成重组慢病毒颗粒;用嘌呤霉素筛选获得CYP39A1过表达的HepG2稳转细胞,采用qPCR和Western Blot检测CYP39A1的mRNA和蛋白相对表达量。[结果]成功扩增CYP39A1基因片段,大小为1451 bp。确定嘌呤霉素在HepG2中的最佳筛选浓度为2.0μg/mL,目的基因CYP39A1被慢病毒成功导入HepG2细胞中,荧光显微镜下能直接观察到EGFP。成功构建CYP39A1过表达及其阴性对照病毒,CYP39A1过表达病毒滴度为1.0×10^(9) TU/mL,阴性对照病毒的滴度为3.0×10^(8) TU/mL。转染CYP39A1过表达组和阴性对照组的qPCR实验结果显示:在HepG2细胞中,过表达组的CYP39A1的mRNA表达量为阴性对照组的516.55±85.24倍(P<0.001)。Western Blot也显示有Flag-CYP39A1的蛋白过表达。[结论]成功构建CYP39A1过表达的HepG2稳转细胞株,且CYP39A1的过表达组mRNA和蛋白均有上调。可为进一步探讨CYP39A1基因在肝细胞肝癌发生发展中的作用提供工具。