蓝莓炭疽病病原菌鉴定及致病性测定

【目的】鉴定辽宁省部分地区疑似炭疽病的蓝莓病株的病原,为蓝莓病害的防控及抗病育种提供依据。【方法】对采自辽宁省兴城市和庄河市的疑似炭疽病的蓝莓发病枝条及叶片进行组织分离、培养,从所分离获得的两类菌株中选择形态学不同的代表菌株LNSW1和B-Cg1进行后续试验和分析。观察两个代表分离菌株在马铃薯葡萄糖琼脂培养基(potato dextrose agar,PDA)上的菌落及分生孢子的形态特征。对代表菌株LNSW1和B-Cg1的真菌核糖体基因进行PCR扩增和测序,采用Mega5.1软件中邻位加入法(neighbor-joining,NJ)进行基于病原菌rDNA-ITS基因序列和GenBank中已有相关炭疽菌序列的系统发育树构建。利用尖孢炭疽菌(Colletotrichum acutatum)和胶孢炭疽菌(C.gloeosporioides)的特异性引物对CgInt2/ITS4和CgInt/ITS4对代表菌株进行特异性扩增,采用菌丝块叶片接种法对8个蓝莓品种进行代表分离菌株的致病性测定。【结果】从辽宁省部分蓝莓产区罹病植株上共分离纯化得到36个菌株,根据各菌株的形态学差异将其分成两个类别,两类别中代表菌株LNSW1和B-Cg1在菌落颜色及分生孢子形态上具有较大差异,且与已报道的炭疽菌属当中的尖孢炭疽菌和胶孢炭疽菌形态特征相似;两个代表分离株的rDNA-ITS序列实际长度为557和547 bp,通过基于真菌核糖体基因的系统发育分析,表明菌株LNSW1与GenBank中尖孢炭疽菌菌株AB729126、KF698729、EU886755聚在同一分支,B-Cg1与胶孢炭疽菌菌株JF923828、KF516931、GU174547聚在同一分支,相似度分别为99%—100%;两对炭疽菌特异性引物扩增结果再次证明所获代表菌株分别为尖孢炭疽菌和胶孢炭疽菌;致病性测定结果表明,尖孢炭疽菌和胶孢炭疽菌菌丝块接种8个蓝莓品种的叶片及枝条均可致病,两类病菌回接症状与田间自然发病症状较为相似,尖孢炭疽菌对蓝莓的致病稍强于胶孢炭疽菌。【结论】通过对辽宁省蓝莓主产区的蓝莓发病枝条及叶片的病原菌进行形态学和分子学鉴定,基本明确辽宁省部分地区的蓝莓炭疽病是由尖孢炭疽菌和胶孢炭疽菌侵染所致。

2000-2005年辽宁省稻瘟病菌种群动态分析

2000-2005年6年间,共分离测定了辽宁省稻瘟病菌411个单孢菌株,经7个中国鉴别品种鉴定,结果划分为7群36个生理小种,在辽宁省流行的优势种群为ZF群和ZE群,近年来致病性强的籼型种群ZA出现频率增加,致病性弱的粳型种群ZF出现频率下降,2001年导致抚9621水稻抗瘟性丧失的ZA25小种2005年又重新出现,上世纪90年代初表现优势的ZG群小种2005年没有检测到。

蓝莓葡萄座腔菌枝枯病研究进展

葡萄座腔菌科真菌是木本果树及林木上的重要病原菌,其中最主要的种葡萄座腔菌(Botryosphaeria dothidea)引起的枝枯病是蓝莓生产中的重要病害之一。综述了蓝莓葡萄座腔菌枝枯病(简称蓝莓枝枯病)的症状特点、侵染过程、发生及流行规律以及综合防治研究,从病害宏观流行学角度提出了亟待解决的病害防控问题。

苹果轮纹病菌DNA提取方法研究

由贝氏葡萄座腔菌梨专化型引起的苹果枝干轮纹病是苹果生产上发生最严重的病害之一，致病菌基因组DNA提取是其分子生物学研究的基础。针对其菌丝富含多糖、纤维素及其他次生代谢物质而且菌丝培养缓慢的特点，用采自辽宁兴城的6个苹果轮纹病菌菌株为试材，进行菌丝的液体和PDA平板培养，然后采用改良的CTAB法从菌丝中提取DNA。通过752型紫外光栅分光光度计检测，所提取的DNA的0D260nm／OD280nm比值介于1．80—2．07之间，最后将所提取的DNA经琼脂糖凝胶电泳得到了较清晰的图谱。证明这两种菌丝培养方法都可用于苹果轮纹病菌DNA提取，但是PDA平板培养是一种更快捷地获得病原菌菌丝的方法；本试验采用的改良CTAB法是提取苹果轮纹病菌DNA的一种有效方法。

苹果白绢病菌生物学特性及室内药剂毒力测定

在辽宁绥中县发现苹果白绢病发生为害,为明确病原菌种类,将采集的病样进行分离培养,并采用柯赫氏法则验证致病性,根据病原菌形态和rDNA-ITS和LSU序列分析对病菌进行分子鉴定,同时进行了病菌生物学特性及防治药剂毒力测定。结果表明,分离株的菌落形态与齐整小核菌Sclerotium rolfsii Sacc.一致,经分子鉴定,其ITS序列和LSU序列与齐整小核菌的有性型序列同源性达100%,将引起苹果白绢病的病原菌鉴定为齐整小核菌。病原菌在10~35℃均可生长,25~30℃时生长最快;病原菌在pH值为3~12时均可生长,碱性环境不适宜病菌生长。室内毒力测定结果显示,戊唑醇、吡唑醚菌酯、噻呋酰胺、咯菌腈和氟硅唑等5种药剂均对白绢病菌有抑制作用,其中,噻呋酰胺抑菌效果最好,EC50值为0.056 5 mg/L。

5种杀菌剂对蓝莓枝枯病菌Neofusicoccum parvum的毒力测定及对病害的防效研究

采用室内菌丝生长速率法测定了代森锰锌、百菌清、戊唑醇、甲基硫菌灵及咯菌腈5种杀菌剂对蓝莓枝枯病菌（Neofusicoccum parvum）的抑制作用，并对盆栽蓝莓和田间蓝莓植株进行了5种杀菌剂的药剂保护及治疗试验。室内毒力测定试验结果表明，代森锰锌、百菌清、戊唑醇、甲基硫菌灵及咯菌腈对蓝莓枝枯病菌菌丝生长均有一定的抑制作用，EC50值介于0．0515—4．1179mg／L，其中以咯菌腈的室内抑菌效果最佳。温室盆栽及田间药效试验结果表明，5种杀菌剂对蓝莓枝枯病均具有一定的预防效果，以百菌清及戊唑醇对枝条的保护效果较好，但对已经发病的枝条无治疗效果。因此，在田间生产中，应注重枝干伤口的保护，及时在修剪后喷施杀菌剂预防病原菌的侵染发生。

蓝莓枝枯病菌Botryosphaeria dothidea的寄主范围研究

以7种果树寄主离体枝条为试材,采用菌丝块接种法,测定了蓝莓枝枯病菌(Botryosphaeria dothidea)的寄主范围,将蓝莓枝枯病菌(B.dothidea)和苹果轮纹病菌(B.dothidea)分别在苹果枝条、果实以及蓝莓枝条上进行交互接种试验。结果表明,蓝莓枝枯病菌还可以侵染桃、李、樱桃、葡萄、苹果、梨等6种果树寄主,来源于我国辽宁地区的蓝莓枝枯病菌与苹果轮纹病菌可以交互侵染。

2015年辽宁省苹果园农药使用情况调查与分析

2016年7—8月中国农业科学院果树研究所植保中心在辽宁省4个苹果主产区部分苹果园进行了农药使用情况调查。通过调查,明确了当前辽宁省苹果主要病虫害种类及发生趋势、不同地区田间农药使用种类和数量,分析了辽宁省苹果病虫害防控中存在的问题,为辽宁省苹果农药减施增效措施的合理制定奠定了基础。

甜樱桃细菌性果斑病病原菌的分离与鉴定研究

甜樱桃细菌性果斑病为近年来发生在辽宁省大连地区樱桃上的一种新病害。经病原菌分离及柯赫法则验证,证明引起该病的病原菌为一种细菌,根据分离株培养特性、生理生化反应、致病性及16S rDNA序列分析,将该病原细菌初步鉴定为成团泛菌Pantoea agglomerans。成团泛菌侵染引起的樱桃果斑病在国内外尚属首次报道。

辽宁省梨黑点炭疽病的病原鉴定及致病性研究

梨树是辽宁省果树产业中重要树种之一,广泛分布于省内各地区。近年来,梨果实黑点在辽宁省梨产区广泛发生,严重影响着梨果实品质,为了有效控制病害发生蔓延,生产上急需明确引起梨果实黑点的病原。通过病原菌致病力测定、形态比较,以及基于多基因的系统发育分析,对采自辽宁省的梨黑点病病原菌进行鉴定。结果表明:形态学与分子鉴定均表明梨黑点病病原菌为暹罗炭疽病菌Colletotrichum siamense;C.siamense在不同梨品种上致病性存在显著差异,其中对‘茌梨’(白梨)致病性最强,对‘南果’‘花盖’(秋子梨)最弱。

辽西地区葡萄灰霉病菌种类及4种杀菌剂对其毒力测定

采用病原菌形态学结合分子生物学方法,对辽西地区葡萄灰霉病菌的种类进行分析,同时利用菌落生长抑制率法,测定了4种杀菌剂对灰霉病菌菌丝生长的毒力作用。结果表明,辽西地区葡萄灰霉病菌为B.cinerea,供试菌株之间基因变异较小;咪酰胺和腐霉利的毒力较高,EC50分别为0.029 3 mg/L和0.520 9 mg/L,百菌清和异菌脲的毒力相对较低,EC50分别为2.5464 mg/L和2.954 4 mg/L。

葡萄根瘤蚜共生细菌分离与分子生物学鉴定

从严格密封温室的盆栽巨峰葡萄根系、寄生的葡萄根瘤蚜虫体和根际土壤中分离获得17个细菌菌株,并对其16S rDNA基因进行PCR扩增和序列分析。结果表明,17个细菌菌株16S rD-NA均扩增出1 500 bp左右的片断,通过与Genbank上已知同源性较高细菌的16S rDNA部分序列对比,初步确定了这17个细菌菌株分属于蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、枯草芽孢杆菌(Bacillus substilis),其中蜡状芽孢杆菌(菌株C2、R2、L2、L3、L4)和巨大芽孢杆菌(菌株L1、L4、R1、R3、C1、B1、B2、J1、J2)集中于葡萄根系和葡萄根瘤蚜虫体,而枯草芽孢杆菌(菌株T1、T2)只在根际土壤中发现,说明蜡状芽孢杆菌和巨大芽孢杆菌为葡萄根系和葡萄根瘤蚜的共生细菌。

辽宁省苹果干腐病的发生与防治措施

苹果干腐病又称苹果树溃疡病,是由有性态为葡萄座腔菌属真菌侵染引起的枝干病害。近年来在辽西及辽南主要苹果种植区广泛发生,并且严重危害苹果树的树体健康及果树产业发展,辽宁省内许多新定植苹果苗木因感染该病菌而死亡,甚至造成新建果园毁园。苹果干腐病的发生率和蔓延区域具有逐年递增的趋势。通过长期的果园田间调研、症状观察及防治实践,笔者对辽宁省苹果干腐病的发生与防治措施有了一定的认识,现将该病害的发生情况与防治措施总结报道如下。

苹果MADS-box转录因子的生物信息学及其在不同组织中的表达

【目的】分析已知苹果(Malus×domestica)MADS-box基因基本信息,研究其在不同组织中表达情况。【方法】利用NCBI数据库查询并获得苹果MADS-box基因,采用CLC Combined Workbench version 6、WebLogo 3、MEGA4.1、MapInspect和MEME等软件对其蛋白序列进行生物信息学分析。采用RT-PCR技术研究MdMADS基因在不同组织中的表达情况。【结果】共得到26个苹果MADS-box基因。MADS-box结构域分析显示,氨基酸10(I)、16-19(RQVT)、22-23(KR)、29-31(KKA)、33(E)、37-39(LCD)、42(V)和48(S)是保守不变的。保守元件分析表明,苹果MADS-box基因包含4个保守元件:元件1、3为MADS盒;元件2、4为K盒。所有苹果MADS-box蛋白都包含有MADS盒(除MdMADS9)和K盒。进化树分析结果显示,苹果MADS基因共分为5个亚组。MdMADS1、3、4、6、7、8、11、18属于SEP亚组;MdMADS2、5、12属于AP1亚组;MdMADS10、14、15、19、22和MdAGL属于AG亚组;MdMADS16、17、21、MdSOC1、MdSOC1a和MdSOC1c属于SOC1亚组;MdMADS13、23和MdPI属于AP3亚组;MdMADS20属于SVP亚组。染色体定位分析显示,MdMADS在8号染色体上分布最多,共有4个;其次是染色体2、14和17,均分布3个;染色体1、5、6、7、11和16均分布1个;染色体3、4、12和15则没有分布。RT-PCR结果分析显示,SEP和AGL亚组表达模式较为一致,主要在花和果实中表达;AP1亚组除在花和果实中表达外,在其它组织器官中也有表达。【结论】苹果MADS-box基因结构高度保守,多数成员参与调控花和果实发育过程。

渤海湾苹果产区主要病虫害发生动态及综合防治策略

全面分析了渤海湾苹果产区主要病虫害的发生动态及防治现状,对造成苹果树主要病虫害动态变化的原因进行了分析,并提出病虫害综合防治策略。

苹果炭疽叶枯病菌GcAP1复合体β亚基基因的克隆及功能分析

【目的】明确衔接蛋白(adaptor protein)GcAP1复合体β亚基在苹果炭疽叶枯病菌(Glomerella cingulata)生长发育和致病过程中的功能,检测GcAP1β在该菌中的时空表达模式,并揭示其是否调控多聚半乳糖醛酸内切酶(endopolygalacturonase)基因CgPG1和CgPG2、果胶裂解酶(pectin lyase)基因pnl-1和pnl-2以及果胶酸酯裂解酶(pectate lyase)基因pelA和pelB的表达,为深入开展苹果炭疽叶枯病菌衔接蛋白在致病信号传导途径中的分子机制研究打下基础。【方法】通过构建GcAP1β基因敲除载体和GcAP1β-gfp融合表达载体,利用农杆菌介导的遗传转化技术(ATMT)获得Δgcap1β突变体和GcAP1β恢复菌株Δgcap1β-GcAP1β,并由RT-PCR和Southern杂交分析进行鉴定。以野生型菌株W16为对照,对Δgcap1β突变体和GcAP1β恢复菌株Δgcap1β-GcAP1β的生长速度、产孢能力、分生孢子萌发率及附着胞形成率和致病性进行测定。利用生物信息学软件Prot Comp 9.0和TMHMM对GcAP1β蛋白进行结构分析,并结合GcAP1β-GFP信号观测,进行GcAP1β的亚细胞定位。利用qRT-PCR技术,检测GcAP1β在菌丝、分生孢子、芽管、附着胞和侵染阶段的表达量,并检测CgPG1、CgPG2、pnl-1、pnl-2、pelA和pelB在野生型菌株和Δgcap1β突变体中的表达量。【结果】GcAP1β基因全长2 321bp,含有3个内含子,编码720个氨基酸。与野生型菌株W16相比,Δgcap1β突变体菌落成褶皱状,菌丝生长速度明显减慢,而分生孢子产量、分生孢子萌发率、附着胞形成率无显著差异。Δgcap1β致病力明显降低,仅在苹果叶片上引起极小的点状斑。GcAP1β基因恢复菌株Δgcap1β-GcAP1β完全修复了因GcAP1β基因缺失造成的表型缺陷。荧光检测显示,融合蛋白GcAP1β-GFP分布于细胞质中。qRT-PCR检测结果表明,GcAP1β在苹果炭疽叶枯病菌各个发育阶段都有表达,且在侵染后表达量相对最高。GcAP1β的缺失导致CgPG1表达量降低至20.3%,CgPG2表达量降低至16.5%,pnl-1表达量降低至8.2%,pnl-2表达量降低至14.4%,pelA表达量降低至4.4%,pelB表达量降至0.8%。【结论】衔接蛋白GcAP1复合体分布于细胞质中,是苹果炭疽叶枯病菌生长发育所需要的;GcAP1调控CgPG1、CgPG2、pnl-1、pnl-2、pelA和pelB的表达,是苹果炭疽叶枯病菌一个重要的毒力因子。

圆黄、黄金等5个砂梨品种果实呼吸和乙烯释放规律

以秋子梨系统京白梨和白梨系统锦丰梨果实为对照,采用500μl/L外源乙烯和1.0μl/L 1-MCP处理,研究圆黄、黄金等5个砂梨品种在常温条件下的呼吸强度和乙烯释放规律变化。结果表明:新世纪、绿宝石和圆黄梨为非呼吸跃变型果实,采后常温呼吸强度乙烯释放量变化不大,外源乙烯处理不能促进呼吸乙烯,1-MCP处理可抑制呼吸强度,但不减少乙烯释放量;黄冠梨和黄金梨具有一定程度呼吸跃变,外源乙烯处理增加果实呼吸乙烯峰,1-MCP处理不能减少乙烯释放量;圆黄梨呼吸乙烯呈双峰型,黄金梨呈波浪型。整体而言,砂梨采后常温呼吸和乙烯整体变化不大,秋子梨(京白)呈先明显上升后下降趋势,而白梨(锦丰)则逐渐升高。

辽西地区苹果树腐烂病调查

通过对辽西地区6个乡镇10个苹果园2010年苹果树腐烂病发病情况进行调查,初步明确了辽西地区苹果树腐烂病的发病率与品种关系不密切,与树龄和管理方式关系密切;发病类型中的枝枯型发病与灌溉关系密切,发病部位以剪锯口发病最多,病斑复发所占比例也较大。加强田间管理、合理修剪、病斑刮治、伤口保护是防治苹果树腐烂病的关键。

生长期喷施氨基酸硒叶面肥对苹果树腐烂病的控制作用研究

在苹果树生长期连续多年喷施氨基酸硒叶面肥的基础上,通过田间调查与室内离体枝条接种,调查氨基酸硒叶面肥对苹果树腐烂病的控制作用。结果显示,生长期喷施氨基酸硒叶面肥可明显提高苹果树枝条对苹果树腐烂病的抗扩展能力,休眠期和生长期离体枝条测定病斑长度分别为15.7、9.7 mm,显著低于对照;喷施氨基酸硒叶面肥新病增长率分别为92.79%、100.98%,显著低于对照;田间平均防效分别为11.52%、27.23%,对控制苹果树腐烂病的发生有一定的作用。

葡萄病毒AMP基因RNA干扰载体的构建

RNA干扰(RNAi)介导的植物抗病毒研究是近年来引起广泛关注的一项植物抗病毒基因工程策略。以GVA运动蛋白(MP)基因为模板扩增出了418 bp的基因片段,根据RNA干扰的基本原理,将目的片段正反向分别插入到载体pFGC5941内含子的两侧以便其转录过程中高效产生RNA发夹结构。经PCR扩增证明已成功构建以GVA MP基因为靶标的干扰载体pFGC5941-GVAFR,并成功转入农杆菌EHA105中,为后续探讨干扰载体的干涉效果奠定了基础。