VEGF基因修饰兔骨髓间充质干细胞的研究(英文)

背景：血管内皮生长因子的应用是组织工程组织血管化的有效手段。但是,血管内皮生长因子价格昂贵,并且半衰期非常短,很难在体内保持有效的作用浓度。故本实验将其转入组织工程的种子细胞——骨髓间充质干细胞中,使骨髓间充质干细胞能够有效地分泌血管内皮生长因子,从而达到促进血管生成的目的。目的：探讨应用人血管内皮生长因子165进行基因修饰的可行性,为血管化组织工程组织的构建及缺血性疾病的治疗奠定实验基础。设计：观察对比实验。单位：吉林大学第一医院和吉林大学再生医学科学研究所。材料：实验于2003-06/2004-08在吉林大学再生医学科学研究所吉林大学重点实验室（生物安全实验室二级）完成。健康新西兰大耳白兔由吉林大学实验动物中心提供。4.0～5.0月龄,体质量215～315kg,雌雄兼用,实验过程中对动物处置均在麻醉状态、无菌条件下完成,符合动物伦理学标准。实验药品及试剂：HamF12培养基（GIBCO公司）,噻唑蓝（MTT）（Sigma公司）,pLXSN-KDRp-VEGF165与pcDNA3.0载体由本实验室自备,ELISA检测试剂盒（深圳晶美生物公司）,感受态大肠杆菌DH5α、限制性内切酶BamHⅠ、XhoⅠ、HandⅢ、EcoRⅠ和标准DNA分子（Promega公司）。方法：分离、培养新西兰大白兔骨髓间充质干细胞。构建并鉴定pcDNA3.0-VEGF165真核表达载体,利用脂质体介导其转染骨髓间充质干细胞,采用ELISA方法检测转基因骨髓间充质干细胞的人血管内皮生长因子蛋白表达,MTT法检测转基因骨髓间充质干细胞表达物对血管内皮细胞增殖活性的影响,设单纯培养骨髓间充质干细胞及pcDNA3.0转染骨髓间充质干细胞组为对照组。主要观察指标：①重组质粒双酶切和基因测序分析。②ABC-ELISA法观察质粒转染后的骨髓间充质干细胞的人血管内皮细胞生长因子蛋白表达。③通过MTT法检测人血管内皮生长因子165基因转染骨髓间充质干细胞培养上清对血管内皮细胞增殖的影响。结果：①构建的质粒用HindⅢ和XhoⅠ双酶切、琼脂糖凝胶电泳鉴定结果与预期完全相同,PCR和酶切鉴定正确后行测序鉴定,测序结果正确,证明所构建的质粒为pcDNA3.0-VEGF165重组质粒。②ABC-ELISA法检测结果表明,人血管内皮生长因子165基因重组载体转染骨髓间充质干细胞后24h,即有较高水平的人血管内皮生长因子165蛋白表达,48及72h呈下降趋势,但与对照组比较,差异显著（P〈0.05）。③MTT法检测人血管内皮生长因子165基因转染骨髓间充质干细胞培养上清对血管内皮细胞增殖的影响,结果显示,含2%,4%,8%,16%和32%转染人血管内皮生长因子165基因的骨髓间充质干细胞培养上清促血管内皮细胞增殖率均高于对照组（P〈0.05）。结论：人血管内皮生长因子165基因可成功地转染至骨髓间充质干细胞中,并可进行有效地表达。

RNAi沉默PTTG基因对恶性胶质瘤U251细胞的影响

目的探讨垂体瘤转化基因(PTTG)siRNA干扰质粒对人脑胶质瘤细胞株U251体外增殖、周期和凋亡的影响。方法利用脂质体将pGenesil-2 PTTG siRNA干扰质粒转染U251细胞,通过MTT法观察转染后24h、48h和72h细胞增殖的变化、流式细胞术PI单染观察转染后48h细胞凋亡和细胞周期的变化。结果pGenesil-2PTTG siRNA干扰质粒转染U251细胞48h后,PTTG mRNA和蛋白的抑制率分别约为69%和71%;阻滞U251细胞由G1期进入S期,抑制细胞的生长,增加了细胞的凋亡。结论PTTG siRNA表达载体可以特异高效地抑制胶质瘤U251细胞PTTG基因的表达,从而调控肿瘤细胞周期,抑制肿瘤细胞增殖。

靶向PTTG和survivin基因共干扰质粒对U251细胞的沉默效率

目的:探讨共干扰质粒pGenesil-2.1-PTTG-survivin siRNA对U251细胞人垂体瘤转化基因(PTTG)和生存素(survivin)基因表达的影响。方法:U251细胞分为5组,分别为正常细胞对照组、Lipo2000+pGenesil-2.1HK组(HK阴性对照组)、Lipo2000+pGenesil-2.1-PTTG siRNA、Lipo2000+pGenesil-2.1-survivin siRNA及Lipo2000+pGenesil-2.1-PTTG-survivin siRNA。应用RT-PCR法、流式细胞术和Westernblotting方法检测转染36h后的各组U251细胞PTTG与survivin基因mRNA和蛋白表达。结果:3个干扰组的U251细胞中PTTG和survivin基因mRNA和蛋白表达水平均较HK阴性对照组显著降低(P<0.01),以共干扰质粒pGenesil-2.1-PTTG-survivin siRNA组降低最明显。结论:共干扰pGenesil1-PTTG-survivin siRNA质粒对U251细胞中PTTG与survivin基因的沉默效应强于单独沉默其中某一基因的干扰质粒。

PTTG靶向siRNA表达载体构建及其沉默效率评价

目的:构建针对人脑胶质瘤细胞系U251的高效率沉默垂体瘤转化基因(PTTG)的小分子干扰RNA(siRNA)表达载体。方法:合成特异性干扰PTTG的siRNA片段,并与pGenesil2载体连接,构建PTTG干扰载体(pGenesil2-PTTG siRNA)。利用脂质体将其转染U251细胞,分为正常细胞对照组、HK阴性对照组和3个siRNA干扰组(pGenesil2-PTTG siRNA1、pGenesil2-PTTG siRNA2和pGenesil2-PTTG siRNA3),应用半定量逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)法和流式细胞术对转染后U251细胞中PTTG的mRNA和蛋白表达水平进行分析。结果:酶切证实PTTG-siRNA表达载体构建成功,插入片段测序结果与合成的siRNA结果一致;转染pGenesil2-PTTG siRNA后,3个干扰组的U251细胞中PTTG基因和蛋白表达水平均较正常对照组显著降低(P<0.01)。结论:成功构建了能高效率沉默PTTG的RNAi表达载体;pGenesil2-PTTG siRNA高效地抑制了胶质瘤U251细胞中PTTG基因的表达。

血管内皮生长因子基因在兔骨髓间充质干细胞中的转染和表达

目的:探讨应用人血管内皮生长因子165(hVEGF165)进行基因修饰的可行性,为血管化组织工程组织的构建及缺血性疾病的治疗奠定实验基础。方法:构建pcDNA3.0-VEGF165真核表达载体,利用脂质体介导转染兔骨髓间充质干细胞(MSCs),ELISA方法检测转基因MSCs的hVEGF蛋白表达情况,MTT法检测转基因MSCs表达物对血管内皮细胞增殖活性的影响,设单纯培养MSCs及pcDNA3.0转染MSCs组为对照组。结果:成功构建hVEGF真核表达载体,并成功地将其转入MSCs中;MSCs细胞在转染pcDNA3.0-VEGF165质粒24、48和72 h后,其培养上清中hVEGF蛋白表达量均较对照组显著升高(P<0.05),至G418筛选后12代,转基因MSCs培养上清中仍有hVEGF蛋白的表达,含2%、4%、8%、16%和32%转基因细胞培养上清的培养液均明显增加血管内皮细胞的增殖率,与对照组比较,差异均具有显著性(P<0.05)。结论:hVEGF165基因成功地转染至MSCs中,并可进行有效地表达。

HP20大型强涡流多通道燃烧器的研究及应用

HP20大型强涡流多通道燃烧器研发是国家科技支撑计划"高性能水泥绿色制造工艺和装备"子项之一。2011年12月10日通过中国建材联合会组织的专家鉴定。本文阐述其技术关键和技术经济指标、试验样机设计和在宝鸡众喜金陵河水泥有限公司5000t/d生产线调试过程,以及劣质煤应用实例。实践表明它是耐磨耐变形性能强、对煤种适应性强的新型多通道燃烧器。可满足水泥生产线大型化、采用劣质燃料、节能和环保的要求。

靶向PTTG和survivin双干扰siRNA表达载体的构建及鉴定

目的:构建同时干扰人垂体瘤转化基因(PTTG)和生存素(survivin)基因表达的RNA共干扰载体,并检测其对人脑胶质瘤U251细胞中PTTG基因和survivin基因的干扰作用。方法:根据GenBank数据库中PTTG和survivin的cDNA序列设计干扰序列,构建干扰PTTG和生存素基因的重组干扰质粒pGenesil-2.1-PTTG siRNA和pGenesil-2.1-survivin siRNA。酶切、测序鉴定正确后,将pGenesil-2.1-Survivin和pGenesil-2.1-PTTG质粒分别进行HindⅢ和BamHⅠ双酶切,1%琼脂糖凝胶电泳分别回收质粒survivin双酶切大片段和质粒PTTG双酶切小片段(约380bp),将质粒survivin回收大片段与质粒PTTG回收小片段进行连接,得到双干扰质粒pGenesil-2.1-PTTG-survivin siRNA,酶切鉴定,同时检测其对U251细胞PTTG和survivin基因mRNA表达的干扰作用。结果:测序和酶切鉴定结果显示,pGenesil1-PTTG、pGenesil1-survivin和双干扰质粒pGenesil2.1-PTTG-survivin siRNA构建正确;RT-PCR结果显示,将双干扰质粒转染U251细胞48h后,U251细胞中PTTG基因和survivin基因mRNA表达明显降低。结论:成功构建了能同时干扰PTTG和survivin基因的双干扰pGenesil1-PTTG-Survivin siRNA表达载体,并可有效抑制U251细胞PTTG和srvivin基因mRNA的表达。

延长回转窑燃烧器寿命的措施

1合理的头部结构保证燃烧器头部不变形 目前我国水泥回转窑基本采用四通道燃烧器,但大部分燃烧器头部采用环缝结构见图1。头部外层钢管采用耐热铸钢,其材质一般为0Cr25Ni20,壁厚一般20～25mm。虽然钢管外层有耐热浇注料保护,但由于水泥回转窑烧成温度一般在1450℃．其火焰温度更高，因此强大的热辐射极易造成头部外管变形。经调查多家水泥生产线．包括采用进口燃烧器的生产线，这种情况为数不少。

机化型慢性硬膜下血肿的影像学特点及临床相关因素分析

慢性硬膜下血肿系外伤后3w以上出现症状的血肿,多见于小儿及老年人,占颅内血肿的10%,硬膜下血肿的25%。血肿位于蛛网膜与硬脑膜之间,有包膜形成。血肿一旦形成,会逐渐增加,大部分均需手术治疗。但仍有部分患者血肿形成后早中期临床症状不典型,晚期最终血肿大部分或全部机化,

^(18)F-FDG PET/CT与MRI对乳腺癌诊断价值的比较

目的:比较18F-FDG PET/CT和MRI在乳腺癌诊断中的作用。方法:选择29例怀疑乳腺癌的患者作为研究对象,10d内进行PET/CT、MRI检查及得到病理结果。以病理结果作为金标准,计算18 F-FDG PET/CT和MRI诊断乳腺癌的灵敏度、特异度及准确度。结果:组织病理学证实在29例患者中,良性肿瘤9例,恶性肿瘤20例。MRI评价乳腺癌的灵敏度、特异度、准确率分别为85.0%、66.7%和79.3%,PET/CT灵敏度、特异度、准确率分别为90.0%、88.9%和89.6%,PET/CT诊断准确度要高于乳腺MRI,但两者之间差异无统计学意义(χ2=1.17,P>0.05);PET/CT通过全身显像还显示了未预测到的左侧锁骨上淋巴结及骨转移3例。结论:在乳腺癌原发灶诊断准确性方面,PET/CT与MRI差异无统计学意义,但在揭示远处转移、准确分期以指导临床治疗方面,PET/CT要优于乳腺MRI。

格尔德霉素对肝细胞生长因子引起的人脑胶质瘤细胞增殖与凋亡变化的影响

目的研究格尔德霉素(GDM)对肝细胞生长因子(HGF)引起的胶质瘤细胞增殖、细胞周期和细胞凋亡的影响。方法U251-MG和U87-MG细胞同步生长后,用HGF作用24h,加入不同剂量GDM(终浓度为50、250、500与1000nmol/L)再处理48h。MTT法检测细胞增殖能力,流式细胞术检测细胞周期时相和细胞凋亡变化。结果与正常对照组相比,单纯HGF组其U251-MG和U87-MG细胞增殖指数显著增高(P<0.05),凋亡百分率显著降低(P<0.05);单纯GDM组这两种肿瘤细胞增殖指数显著低于正常细胞(P<0.05),凋亡细胞百分率显著高于正常组(P<0.05),且随浓度增加其增殖抑制作用逐渐增强,1000nmol/L的GDM对HGF的抑制效果最好;HGF联合不同浓度GDM组其增殖指数则显著高于单纯GDM组,凋亡细胞百分率显著低于GDM组;同时HGF联合不同浓度GDM组其细胞G0/G1期细胞表达百分率显著高于GDM组(P<0.05),而G2/M期细胞表达百分率显著低于GDM组(P<0.05)。结论GDM能抑制HGF诱导的胶质瘤细胞的增殖,并促进其凋亡,即GDM对HGF的增殖促进及凋亡抑制作用具有逆转能力。

格尔德霉素对HGF诱导的人胶质瘤细胞MMP-2及MMP-9活性的影响

目的研究格尔德霉素(geldanamycin,GDM)对肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)诱导的人胶质瘤细胞基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMP)-2及MMP-9活性的影响。方法应用细胞培养技术培养人恶性胶质瘤细胞系U251-MG和U87-MG,用酶谱法测定MMP-2及MMP-9活性。结果HGF作用24h后,U251-MG细胞中MMP-2及MMP-9活性较正常组明显增强(P<0.05);而GDM组则能够显著抑制其活性(P<0.05),并且1000nmol/L的GDM对HGF诱导的肿瘤细胞MMP-2及MMP-9活性增强有明显抑制作用(P<0.05)。结论GDM能够抑制胶质瘤细胞MMP-2及MMP-9的表达,而且对HGF诱导的人胶质瘤细胞MMP-2及MMP-9的活性增强具有明显抑制作用。

全身多发结核患者^(18)F-FDG PET/CT显像误诊为肺癌腰椎转移1例报告

1临床资料 患者,男性,42岁,因胸腰部疼痛6个月余就诊。MRI检查示：T11和L2椎体病变,为查明原发灶,在本科行18F-脱氧葡萄糖（18F-FDG）正电子发射断层显像（PET/CT）检查。病程中患者无发热、盗汗、消瘦、乏力,咳嗽、咳痰和咯血等症状;体格检查未见异常。肿瘤标志物癌胚抗体（CEA）、神经元异性烯醇化酶（NSE）及细胞角质素片段抗原（CYFRA21）水平均在正常范围内。按体质量5MBq.kg-1静脉注射18F-FDG,

含金属硫蛋白蛋奶粉对小鼠肝细胞实体瘤的治疗作用

目的：观察含金属硫蛋白（MT）蛋奶粉对荷瘤小鼠肝癌有无治疗作用。方法：70只BALB/c小鼠随机分为正常对照组10只、荷瘤鼠组20只、低剂量和高剂量含MT蛋奶粉肿瘤治疗组各20只。除正常对照组小鼠外，在其余小鼠体内移植H-22小鼠肝癌细胞株形成移植性肝癌模型，连续用含MT蛋奶粉给荷瘤小鼠灌胃2周后，每组断头处死10只小鼠，取其脾脏，采用MTT法检测各组小鼠淋巴细胞转化功能和IL-2活性，及流式细胞术检测脾脏CD4＋、CD8＋和CD25＋T细胞百分率以及淋巴细胞周期进程和凋亡的变化，以及3H-TDR掺入法检测CTL和NK细胞杀伤活性，并采用细胞病变抑制法检测小鼠IFN-γ活性以及L929体外杀伤法检测TNF-α活性。并于开始灌胃MT蛋奶粉后的第21-31天观察小鼠肿瘤大小。结果：在BALB/c小鼠形成肝癌第27、29及31天，含低剂量和高剂量MT蛋奶粉组小鼠肿瘤体积均明显小于肿瘤对照组（P〈0.05）；含低剂量和高剂量MT蛋奶粉肿瘤治疗组淋巴细胞刺激指数（SI）较肿瘤对照组均显著增加（P〈0.01），含高剂量MT蛋奶粉肿瘤治疗组小鼠脾脏CD4^＋细胞百分率及CD4^＋/CD8^＋比值较肿瘤对照组均显著增加（P〈0.01，P〈0.05），其CD25^＋T细胞百分率较肿瘤对照组显著降低（P〈0.01）；与肿瘤对照组比较，含高剂量MT蛋奶粉肿瘤治疗组小鼠淋巴细胞G0/G1期细胞百分率显著降低（P〈0.05），G2/M期细胞百分率显著增加（P〈0.05）；同时，含高剂量MT蛋奶粉肿瘤治疗组小鼠淋巴细胞凋亡百分率较肿瘤对照组（荷瘤鼠组）显著降低（P〈0.05）；荷瘤小鼠脾脏CTL细胞毒活性显著低于正常对照组（P〈0.05），含高剂量MT组CTL细胞毒活性显著高于荷瘤小鼠（P〈0.05）；荷瘤小鼠脾脏NK细胞毒活性明显低于正常对照组（P〈0.05），而含MT肿瘤治疗组NK细胞毒活性明显高于荷瘤组小鼠，尤其以高剂量组为显著（P〈0.01）。与肿瘤对照组比较，含高剂量MT蛋奶粉显著增加了荷瘤小鼠的IL-2和TNF-α活性（P〈0.01），含低剂量MT蛋奶粉对荷瘤小鼠的TNF-α活性亦有明显提高作用（P〈0.01），对IFN-γ活性并无显著影响。结论：含MT蛋奶粉对肿瘤的治疗性效应可能是通过增强荷瘤小鼠的免疫功能实现的。

丘脑胶质瘤的临床特征与手术治疗的分析

目的研究丘脑胶质瘤的临床特征、诊疗方法和手术技巧。方法回顾性分析我院经手术治疗的39例丘脑胶质瘤患者的临床表现、肿瘤影像学特点和手术治疗效果。结果丘脑不同类型胶质瘤影像学表现、全切率不尽相同。病程7d～3．5年,平均3．1月。肿瘤颅内压增高症状最为常见(90%),轻偏瘫56%,不自主运动10%,智力减退或精神症状30%;全组患者肿瘤手术全切率为53%,次全切率为29%,部分切除率为18%;出院时好转、稳定者占79%,恶化及出现新体征者占21%;手术死亡率为0。结论MRI是目前诊断丘及肿瘤的最好检查方法。肿瘤的病理分类与临床症状、影像特征及手术效果均有关。

金属硫蛋白对急性化学性肝损伤的保护作用研究

[目的]研究含金属硫蛋白(metallothionein,MT)蛋奶粉对CCl4致大鼠急性肝损伤的保护作用。[方法]70只Wistar大鼠随机分为正常对照组10只、模型组20只、低和高剂量MT蛋奶粉治疗组各20只。低和高剂量MT蛋奶粉治疗组大鼠以含MT蛋奶粉灌胃1周,然后对除正常对照组以外的大鼠复制CCl4肝损伤模型,于造模当日,正常对照组和模型组大鼠用蒸馏水,治疗组用含MT蛋奶粉连续灌胃2周后,断头处死大鼠,观察各组大鼠血清酶类含量的变化和肝脏过氧化物质和抗氧化酶类(SOD、CAT)和GSH含量的变化。[结果]与正常对照组相比,模型组大鼠血清中ALT、AST、GGT和ALP含量显著升高(P<0.01),而含MT蛋奶粉治疗组大鼠血清中ALT、AST、GGT和ALP含量均显著低于模型组,尤其以高剂量组为显著(P<0.01)。含MT蛋奶粉组大鼠肝脏MDA含量显著低于模型组(P<0.01),抗氧化酶类SOD活性和抗氧化物质GSH含量显著高于模型组(P<0.05或P<0.01),对CAT活性并无显著性影响。[结论]含MT蛋奶粉对CCl4造成的大鼠急性肝损伤具有一定程度的保护作用。

亲环素A蛋白表达水平与人脑胶质瘤分级相关性研究

目的:探讨亲环素A(CypA)蛋白表达水平与人脑胶质瘤分级之间的关系.方法:采用免疫组化ABC法观察不同病理级别人脑胶质细胞瘤标本45例和正常脑组织10例中CypA蛋白表达情况,比较各级之间表达率的差异.结果:正常脑组织CypA蛋白表达率为0,45例脑胶质瘤组织CypA蛋白总阳性表达率为60.0%,较正常脑组织有显著差异;各级脑胶质瘤CypA蛋白表达阳性率分别为Ⅰ级16.7%,Ⅱ级40.0%,Ⅲ级69.2%,Ⅳ级81.3%,低级别(Ⅰ～Ⅱ级)组为31.3%,高级别(Ⅲ～Ⅳ级)组为75.9%,两组之间CypA蛋白表达有显著差异(P<0.01).结论:CypA蛋白的表达水平与人脑胶质瘤病理分级相关.

以头胀痛和头晕为主要表现的右侧颞叶少突星形细胞瘤1例报告

少突星形细胞瘤是指由2种不同类型的肿瘤细胞构成的肿瘤,细胞形态类似少突胶质细胞瘤和弥漫型星形细胞瘤,WHOⅡ级。少突星形细胞瘤症状和体征同星形细胞瘤和少突胶质细胞瘤,常见癫痫、轻瘫、性格改变和颅高压症。临床上以头胀痛、头晕为主要表现的少突星形细胞瘤较少见。现将1例以头胀痛和头晕为主要表现的少突星形细胞瘤患者的临床资料报道如下。