人胰岛素样生长因子-1的体外抗肝纤维化活性

探讨人胰岛素样生长因子-1(IGF-1)的体外抗肝纤维化作用。检测IGF-1对人正常肝细胞L-02增殖及生长周期的影响;建立CCl_4诱导的肝细胞损伤模型,探究IGF-1抗肝细胞损伤活性;以TGF-β1诱导的肝星状细胞HSC-T6为体外肝纤维化研究模型,检测IGF-1对HSC-T6细胞中纤维化相关蛋白表达水平及对胞内TGF-β1/Smad信号通路的影响。结果显示,IGF-1可解除TGF-β1对L-02生长的抑制作用,提高CCl4损伤L-02的细胞存活率,降低HSC-T6细胞纤维化相关蛋白表达水平,抑制TGF-β1/Smad信号通路中Smad3的磷酸化。结果表明,IGF-1能够促进肝细胞增殖,保护肝细胞免受损伤,干预TGF-β1/Smad信号通路,抑制胞外基质ECM合成,从而发挥抗肝纤维化效果。

硫氧还蛋白促进人胰岛素样生长因子-1在大肠杆菌中高效可溶表达

为实现人胰岛素样生长因子-1(Insulin-like growth factor-1,IGF-1)在大肠杆菌中的高效可溶表达,获得大量具生物活性的IGF-1。应用融合PCR技术构建trx-igf1融合基因,克隆至p ET30a载体。重组载体pET30a-Trx-IGF-1转化大肠杆菌C43(DE3),并进行条件优化大量表达可溶性蛋白Trx-IGF-1。利用His标签纯化表达产物,对纯化蛋白进行Western blot与生物活性分析。构建的pET30a-Trx-IGF-1重组载体转化大肠杆菌C43(DE3)后,在30℃培养条件下1 mmol/L IPTG诱导表达5 h,获得大量以可溶形式表达的融合蛋白Trx-IGF-1;采用Ni离子亲和层析,获得纯度达90%以上的融合蛋白,经Western blot检测具有IGF-1抗原活性。生物学活性检测显示,融合蛋白Trx-IGF-1能明显促进NIH3T3细胞增殖及细胞周期进展。本研究应用的载体蛋白Trx,能实现在大肠杆菌中高效可溶表达具生物活性的IGF-1,为包涵体蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达提供借鉴。

灰绿藜耐盐基因CgNHX转导新疆陆地棉的初步研究

以新疆陆地棉为实验材料,通过花粉管通道法向优质棉花高代材料中导入了灰绿藜耐盐基因CgNHX.经过三年连续转导的结果显示:①大田注射期间的天气状况对转导成功影响较大.当昼夜温差较大且有露水时,花和铃的状态较好,导致结铃率、卡那霉素检测阳性率增加;②棉叶基因组DNA的提取质量与棉叶采后冷藏的时间有一定相关性.采后一周内提取的棉叶DNA质量较好,PCR检测获得30%的阳性率,而两周及以后的棉叶DNA质量降低,PCR检测未获得阳性结果;③在mRNA水平上检测转基因植株的表达较为困难.本实验中PCR检测阳性的30份样品,在RT-PCR检测中均未获得目的基因的明显特异扩增条带,只有部分样品在目的条带的位置出现弥散带型.本研究初步显示外源基因CgNHX已导入棉花受体中,但其表达情况还需进一步检测验证.

肝纤维化与干细胞疗法

肝纤维化是常见的慢性进行性肝病,是肝脏细胞在一种或多种病因长期或反复作用下进行应激反应的过程。肝纤维化过程中,胞外基质大量累积形成瘢痕组织,引起肝脏功能减退或衰竭,严重危害生命健康。多个独立的研究证明,干细胞治疗促进肝纤维化恢复。干细胞治疗过程中,干细胞迁移至肝损伤部位,通过旁分泌途径改善纤维化瘢痕区域的微环境,延缓纤维化进程。该文从肝纤维化形成过程、肝纤维化治疗和干细胞疗法三方面进行综述。

新疆干旱区植物藜的种子异型性及其萌发机理

新疆干旱区分布的植物藜(Chenopodium album)的种子有黑色和褐色两种类型。对藜的异型性种子从形态结构、不同环境因素及激素或化学物质对萌发的影响以及同工酶谱等方面进行了研究,并对其萌发及适应异质环境的机理进行了讨论。结果表明:(1)藜的异型性种子在形态结构、萌发休眠特性等方面都存在明显差异:黑色种子种皮厚且硬,休眠,萌发慢,萌发率低;褐色种子种皮薄而软,不休眠,萌发快且萌发率高;(2)黑色种子的休眠可通过切除胚根外缘种皮得以完全解除;(3)赤霉素、乙烯利对黑色种子的萌发无明显促进作用;KNO3可较显著促进黑色种子的萌发;协同使用乙烯利和KNO3时,可显著提高黑种子萌发率,完全打破休眠;(4)黑色种子和褐色种子的酯酶、过氧化物酶及过氧化氢酶同工酶谱带存在差异;(5)黑色种子的萌发需要光照,而褐色种子则对光不敏感;低温贮藏对二者的萌发均无显著影响,尽管黑色种子的萌发率有波动。研究结果初步显示黑色种子的休眠是内源(胚)和外源(种皮)因素共同所致。藜的种子异型性及其萌发机理的形成是其对新疆干旱区异质化环境的高度适应。

不同盐胁迫对新疆耐盐植物藜叶片钾、钠元素含量及相关基因表达的影响

为应对日益严峻的土壤盐渍化问题,研究具有应用前景的盐生及耐盐植物对盐胁迫的响应机制已成为近年来的热点。实验采用电感耦合等离子体原子发射光谱法(ICP-AES)测定了NaCl和KCl长期胁迫下新疆耐盐植物藜叶片K和Na元素的含量,以半定量RT-PCR方法对参与离子转运的3个基因NHX,VP1和VAP-C的表达水平进行了检测,就不同盐胁迫对K和Na元素含量影响的机制进行了初步讨论。结果表明:(1)藜在低浓度NaCl胁迫时可选择性吸收钾离子,从而避免钠离子在植物体内的积累;(2)藜在高浓度NaCl胁迫时有较强的富集钠离子能力,过量的钠离子可通过液泡膜离子转运系统区隔至液泡,进而维持细胞质内正常的钾钠离子平衡;(3)藜不能耐受高浓度KCl胁迫,可能与其在细胞质内积累大量的钾钠离子有关。研究初步表明,藜能够耐受较高浓度的NaCl胁迫,且对Na+具有较强的富集能力,这为今后利用其改良盐渍化土地及开发这一耐盐植物奠定了基础。

抱茎独行菜种皮粘液质相关基因TTG1的克隆、表达分析及功能鉴定

抱茎独行菜(Lepidium perfoliatum L.)为十字花科具典型粘液质繁殖体植物,而TTG1基因(Transpa-rent testa glabra 1)所编码的蛋白是调控种皮细胞分化并影响粘液质释放的转录因子。目前关于TTG1基因在粘液质繁殖体植物中的研究报道较少,为探究TTG1基因在抱茎独行菜粘液质发育中的作用,本研究利用同源克隆技术获得抱茎独行菜TTG1基因cDNA开放阅读框(ORF)序列,命名为LpTTG1。序列分析表明,该基因ORF全长为1032 bp,编码343个氨基酸,含有WD40基序;qRT-PCR分析结果显示,该基因在抱茎独行菜各组织中均有表达,反映了该基因功能的多样性;免疫组织化学定位结果表明,LpTTG1在种子发育过程中内珠被和外珠被的表达水平变化与外珠被粘液质的合成过程相一致,推测该基因可能参与调控抱茎独行菜种皮的发育及粘液质的形成。将LpTTG1基因转化拟南芥,该基因的过量表达显著促进了粘液质合成途径下游基因AtMUM4在角果中的表达,表明该基因有可能参与粘液质合成途径调控,并促进下游产物MUM4的产生。然而,对LpTTG1转基因拟南芥与野生型植株表型的比较发现,两者种子形态及粘液质分泌与释放方式均无显著差异,这可能是因为抱茎独行菜种皮发育和粘液质形成是一个多基因调控的复杂过程,某一基因的过量表达也许不会引起明显的表型变化。

室外人工种植抱茎独行菜种子破除休眠的初步研究

【目的】初步探索室外种植的抱茎独行菜(Lepidium perfoliatum L.)种子破除休眠的方法,为深入研究其种子粘液质特性和农业栽培、开发抱茎独行菜这种优质牧草提供丰富的物质基础。【方法】以室内种植的抱茎独行菜种子为材料,采用不同化学和物理方法处理其种子,测定其种子的萌发率。【结果】(1)4℃、GA3、H2O2单独处理以及GA3与H2O2组合处理均可打破抱茎独行菜种子的休眠;(2)GA3与H2O2共同处理效果最好,其中以500 mg/L GA3处理3 d后15%H2O2处理20 min的种子萌发率最高,可高达94.44%。【结论】推测造成室内种植的抱茎独行菜种子休眠的可能原因是种胚的活力不够,从而使得其种子在萌发过程中不能有效挣脱种皮的机械束缚从而导致休眠。

抱茎独行菜MUM4基因的克隆及分析(英文)

抱茎独行菜(Lepidium perfoliatum L.)为十字花科具典型粘液繁殖体植物,为探究该植物中种皮粘液质基因(MUCILAGE-MODIFIED4,MUM4,该基因在拟南芥中编码NDP-L-鼠李糖合成酶)的功能,通过生物信息学分析设计引物克隆得到抱茎独行菜MUM4基因,命名为LpMUM4。同源比对分析结果表明,LpMUM4与拟南芥AtMUM4基因具有很高的一致性。qRT-PCR结果表明,该基因在抱茎独行菜各组织中均有表达,在角果和根中的表达量最高,且其表达量随角果的发育表现出渐强的趋势。免疫组织化学定位分析表明,LpMUM4基因于角果发育的早期阶段在内珠被和外珠被都有表达,而在外珠被的表皮和亚表皮中表达量更高,至角果发育的最后阶段,其表达集中于表皮和亚表皮层,这可能与抱茎独行菜的外珠被发育成种皮及粘液质的生成有关。将LpMUM4基因转化拟南芥,该基因的过表达对位于粘液质合成途径中的上游基因AtTTG1具有显著的抑制作用。表型比对观察显示,转基因拟南芥与其野生型植株形态无显著差异,这可能是因为抱茎独行菜种皮的发育和粘液质的形成是一个多基因调控的复杂过程,某一基因的过表达或许不会引起明显的表型变化。

新疆耐盐植物藜的甜菜碱醛脱氢酶基因(CaBADH)的克隆、盐胁迫表达分析及植物表达载体的构建

【目的】为开展植物耐盐基因工程提供候选基因。【方法】研究以新疆耐盐植物藜为材料,利用同源克隆技术从藜中克隆到BADH基因,并通过RT-PCR方法对其在不同盐胁迫下的表达进行了初步分析,随后将该基因构建至高效植物表达载体pCN2300上。【结果】(1)经测序分析并与藜科其他植物进行同源性比对显示,得到的序列为藜的BADH基因,开放阅读框长度为1503bp,编码500个氨基酸;(2)以BADH基因核心序列设计引物对此基因在盐胁迫下的表达进行了RT-RCR分析,发现其本底表达量较高,以100mmol/LNaCl处理2、5、12和24h后其表达量没有明显增加趋势,而以50mmol/LNaCl或KCl长期胁迫后其表达量则比对照和100mmol/L时的表达量高;(3)经双酶切鉴定,已成功将CaBADH基因构建到植物表达载体pCN2300,得到重组质粒pCN2300-CaBADH。【结论】研究为进一步从生理和分子水平阐明藜的耐盐机制提供了一定参考。并为通过转基因技术获得耐盐作物新品种打下基础。

粘液繁殖体植物抱茎独行菜TTG1基因转化拟南芥的表型研究

[目的]将过量表达典型粘液繁殖体植物抱茎独行菜TTG1基因(LpTTG1)的转基因拟南芥株系表型与野生型和突变体进行比较,为深入研究LpTTG1基因的功能提供参考依据。[方法]在体视显微镜下,通过对拟南芥野生型、ttg1突变体及LpTTG1基因过表达转基因株系的植株表型,幼苗叶表皮毛、下胚轴和根毛以及种子形态进行观察比较。[结果]拟南芥ttg1突变体与野生型和LpTTG1过表达转基因型的幼苗在下胚轴的颜色、根毛着生方式、真叶表皮毛等方面有显著差异,但后两者表型间无显著差异。[结论]缺失TTG1基因可导致拟南芥幼苗形态发生显著变化,但此基因过量表达不一定对拟南芥形态产生影响。

大麦与油菜种皮特异启动子表达模式的比较

启动子位于转录起始位点上游并能特异性地结合RNA聚合酶,其作为调控序列驱动外源基因在异源植物中表达,从而实现转基因的高效性,具有时空表达特异性的启动子对获得有效转基因植物及产物具有重要意义。为了解种皮特异启动子的表达模式,该研究基于前期报道的序列,通过同源克隆的方法分别从大麦和油菜中克隆获得Gerb和Bntt两个种皮特异性启动子,并对其进行生物信息学分析,构建了Gerb::GUS和Bntt::GUS植物表达载体并转化拟南芥,通过组织化学染色观察了GUS的表达情况。结果表明:两种启动子序列中都含有多拷贝种皮特异表达启动子元件以及多种胁迫诱导响应元件;转基因拟南芥幼苗期,大麦Gerb种皮特异启动子驱动GUS全株表达且子叶和下胚轴较真叶和根中表达量高;油菜Bntt种皮特异启动子表达较弱;成株期,Gerb在不同组织(叶片、茎、花序和角果)中均有表达,未显示组织特异性;Bntt仅在叶片及角果维管束中有微弱表达。在各种非生物胁迫下,Gerb表达模式未发生显著变化,而Bntt仅在盐胁迫下显示很强的角果和种子特异性表达,其他胁迫未见明显表达。以上结果显示,大麦种皮特异性启动子Gerb和油菜种皮特异性启动子Bntt在时间和空间表达模式上存在差异,这对今后选择种皮特异启动子具有参考作用,但其具体机制仍需进一步研究验证。

甲状旁腺激素-人血清白蛋白融合蛋白在CHO细胞中的表达

人甲状旁腺激素是由人甲状腺旁腺主细胞分泌合成的一种单链多肽激素,成熟的甲状旁腺激素含84个氨基酸残基,其活性区域为N-末端1-34氨基酸片段,目前已上市的PTH药物也以34个氨基酸残基的多肽为主,主要用于治疗老年骨质疏松以及绝经后妇女骨质疏松。但是PTH的稳定性较差,导致体内半衰期短,难以形成有治疗作用的稳态血药浓度,从而限制了其临床应用。因此,设计稳定并能保持原有生物活性的PTH药物分子至关重要。构建含有融合蛋白基因PTH-HSA的p MH3质粒,并通过电转染的方法转入中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary cell,CHO细胞)中,利用p MH3质粒所携带的NEO基因进行筛选,最终得到能稳定表达目的蛋白的重组细胞,并在5L发酵罐中进行表达,融合蛋白PTH-HSA表达量达到155mg/L。Western blot检测显示,该融合蛋白同时具有HSA和PTH双重免疫原性。

信号肽对肝细胞生长因子HGF在CHO中表达及分泌的影响

该研究旨在筛选不同的分泌型信号肽以提高肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)在中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary cell,CHO)中的表达。通过PCR方法将5种不同的分泌型信号肽代替HGF自身信号肽,分别构建了表达质粒并转化哺乳动物细胞CHO,挑选高表达克隆。采用qPCR方法检测表达过程中HGF转录水平差异,Western blot检测CHO培养基中HGF的累积差异,犬肾细胞(Madin-Daby canine kidney cells,MDCK cells)离散实验初步验证HGF的活性。研究结果表明,不同的分泌型信号肽对CHO表达HGF过程中的转录水平没有影响,但明显改变HGF在培养基中的累积,对分泌的HGF活性没有影响。综上所述,合适的分泌型信号肽促进CHO分泌外源蛋白质。

新疆短命植物独行菜的组织培养与植株再生

1植物名称独行菜（Lepidium apetalum Willd）。2材料类别无菌苗下胚轴。3培养条件（1）愈伤组织诱导培养基：MS＋6-BA1.0mg·L-1（单位下同）＋NAA1.5;（2）不定芽诱导与继代增殖培养基：MS＋6-BA2.0＋NAA0.5;（3）生根培养基：1/2MS＋NAA0.2。

融合蛋白HSA-HGF的体内抗肝纤维化活性

肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)在治疗肝纤维化过程中扮演着重要角色,但其在血液循环中并不稳定,半衰期短,提高HGF在血液循环中的稳定性是HGF应用性研究的重要内容。作者在课题组前期研究的基础上,对人血清白蛋白(human serum albumin,HSA)融合蛋白HSA-HGF的体内抗肝纤维化能力进行了研究。通过CCl4诱导构建小鼠肝纤维化模型,并设置(1)正常组、(2)模型组、(3)阳性组、(4)HSA组、(5)HGF治疗组、(6)HSA-HGF治疗组。经过苏木素-伊红染色、Masson染色、血清肝功能指标活性检测、qRT-PCR法检测肝组织中α-SMA和COLⅠ基因转录水平、TRFIA法检测体内半衰期,从而鉴定各组抗肝纤维化效果。结果显示:1)运用CCl4构建肝脏损伤小鼠模型,药物作用后结果显示融合蛋白HSA-HGF及其单体药物均可以明显地促进小鼠的肝脏恢复;2)与单体药物相比,融合蛋白HSA-HGF在降低给药频率的情况下能取得相当的治疗效果;3)小鼠体内半衰期分析显示,融合蛋白的体内半衰期由单体的3 min增加到3 h左右。表明融合蛋白HSA-HGF具有明显的抗纤维化效果,与单体药物相比,融合蛋白药物的半衰期明显延长,表明该融合蛋白稳定性更佳,具有成为抗肝纤维化药物的潜力。

骨形态发生蛋白10在中国仓鼠卵巢细胞中的表达、纯化及其生物活性

目的在中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary,CHO)中表达改造后的骨形态发生蛋白10(bone morphogenetic protein 10,BMP10)全长基因,纯化后检测其生物活性,以期获得具有生物活性的BMP10分子。方法于rh BMP10的propeptide与mature chain基因片段之间插入6×his-tag标签及DDDDK(肠激酶识别位点),构建p MH3-rh BMP10-histag-DDDDK质粒,电转入CHO细胞,用500μg/ml G418从单克隆中筛选出稳定表达目的蛋白的重组细胞,悬浮驯化表达8 d后,收集培养液上清,阴离子交换柱和镍柱纯化目的蛋白。采用q-PCR法检测纯化蛋白的体外细胞活性。结果目的蛋白纯化液经SDS-PAGE检测到的条带相对分子质量与目的蛋白理论值相符,Western blot分析可见相对分子质量约48 000、96 000和190 000的3个条带,与目的蛋白单体及多聚体相对分子质量一致。酶切后的目的蛋白可有效刺激P19细胞的标志蛋白(Smad6)表达上调。结论 BMP10 propeptide的存在对BMP10的蛋白活性具有重要作用,改造后的BMP10在CHO细胞中表达具有一定的生物活性。本研究为全长BMP10活性二聚体的制备提供了新的思路。

环境因素对短命植物抱茎独行菜抽薹开花节律的影响

以新疆十字花科典型早春短命植物抱茎独行菜(Lepidium perfoliatum L.)为材料,分别在不同环境、不同土壤基质及不同春化时间下栽培,以探讨环境因素对抱茎独行菜抽薹开花的影响。结果表明:抱茎独行菜种子在蛭石∶珍珠岩(3∶1)中的出苗率显著高于营养土和自然生境土壤,基质对抱茎独行菜植株是否抽薹无显著影响,但影响其抽薹的早晚及结实特性;人工4℃春化对3种不同栽培环境中于阳台生长植株的抽薹有明显促进作用,而对培养室及户外环境中栽培植株是否抽薹无显著影响;抱茎独行菜抽薹开花对光照和温度的响应最明显,光照时间由短变长与苗期一定时间的低温之间的相互作用是促使抱茎独行菜抽薹开花的关键因素。

让学校教育充满阳光——淮安市实验初中“阳光教育”特色建设纪实

坚持不懈地追求高质量高目标的积极进取精神,群策群力共同研究的团结协作精神,对学生怀有深厚感情和舐犊之情的母爱精神淮安市实验初级中学创办于1964年。48年来,学校经历了企业办学、合作办学、民办、公办四个时期,是一所办学历史较长、经历十分丰富的学校。近年来,学校领导班子围绕杨局长提出的"把这所优质学校办成名校"的要求,在系统总结学校办学历史经验和教育发展趋势的基础上,提出了"小规模、现代化、高质量、有特色"的办学思路,把建设"领导放心、教师舒心、学生开心、家长满意"