成熟前后水牛卵母细胞蛋白质组的初步研究

应用聚丙烯酰胺凝胶电泳联合反相液相色谱-串联质谱(RP-LC-MS/MS)蛋白质组学技术,研究GV期和MII期水牛卵母细胞蛋白质组,以期为揭示水牛卵母细胞体外成熟分子机理、筛选与卵母细胞成熟质量相关蛋白质奠定理论基础。从GV期和MII期水牛卵母细胞中分别鉴定到647和570种蛋白质(FDR<1%)。其中,鉴定相同蛋白质414种;GV期和MII期卵母细胞特有鉴定蛋白质分别为233种和156种。通过谱图计数法获得鉴定蛋白质的半定量信息,从GV期和MII期水牛卵母细胞中筛选到9种高丰度蛋白质。其中8种为相同蛋白质,包括穹窿体蛋白、谷胱苷肽S-转移酶M3、蛋白精氨酸脱亚氨酶6、过氧化物氧化还原酶2、二磷核苷酸激酶B、动力蛋白轻链1、醛糖还原酶、类甘油醛-3-三磷酸脱氢酶同源物2等。热激蛋白90α和谷胱甘肽S-转移酶P分别为GV期和MII期水牛卵母细胞特有的高丰度蛋白质,这些蛋白质可能与水牛卵母细胞成熟过程密切相关。GO(Gene Ontology)和KEGG分析显示,鉴定相同蛋白质主要集中在丙酮酸盐代谢、三羧酸循环(TCA)、糖酵解/糖原生成、磷酸戊糖途径等能量代谢通路,提示水牛卵母细胞成熟过程中可能需要维持高的能量代谢水平,以保证卵母细胞减数分裂的完成。GV期细胞特有鉴定蛋白质主要集中在氧化磷酸化、核糖体以及蛋白酶体等KEGG通路,表明GV期卵母细胞可能具有高的氧化磷酸化和蛋白合成水平,蛋白酶体在推动水牛卵母细胞成熟进程中可能发挥重要作用。MII期细胞特有鉴定蛋白质主要集中在DNA复制和氨基糖、核苷糖代谢等KEGG通路,提示水牛卵母细胞可能在为后续的受精过程和早期卵裂进行遗传物质的准备。综上表明,成熟前后水牛卵母细胞蛋白质表达模式,为进一步深入了解水牛卵母细胞成熟分子机理奠定理论基础。

钙对感染白粉菌甜瓜幼苗中苯丙烷类物质代谢的影响

采用钙和钙离子螯合剂EGTA喷施甜瓜幼苗叶片,研究了外源钙对接种白粉菌甜瓜叶片中苯丙氨酸解氨酶(PAL)、多酚氧化酶(PPO)、过氧化物酶(POD)活性以及阿魏酸、木质素、绿原酸含量的影响。结果表明,喷施CaCl2的植株再接种白粉菌时,叶片中PAL、PPO、POD的活性以及阿魏酸、木质素、绿原酸含量都显著高于未接种的对照1(K1)和单独接种白粉菌的对照2(K2);而喷施EGTA的植株再接种白粉菌时,酚类物质含量及相关酶活性则低于对照2。以上结果说明,外源钙通过提高甜瓜叶片中相关酶的活性积累酚类物质,诱导对白粉病菌的抗性,而钙信号系统则可能参与了这个过程。

嵌合IL-21的重组溶瘤流感病毒构建及其在肝癌中的溶瘤机制

目的拯救嵌合白细胞介素-21(interleukin-21,IL-21)的重组溶瘤流感病毒,评价其对肝细胞癌的抑制效果及安全性,并探索其联合程序性死亡受体1(programmed cell death-protein 1,PD-1)抗体增强抗肿瘤作用的机制。方法将IL-21基因片段插入流感病毒PR8的非结构蛋白(nonstructural protein,NS)序列,利用反向遗传学(reverse genetics,RG)技术,拯救重组溶瘤流感病毒rOV-IL-21-NS;采用半数组织培养感染剂量(50%tissue culture infectious dose,TCID50)和血凝实验测定病毒滴度和毒力;采用反转录定量聚合酶链反应(reverse transcription quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)、凝胶电泳和测序分析验证外源基因是否成功插入NS序列;通过透射电镜观察病毒形态特征及大小,采用CCK-8检测其对肝癌细胞活力的影响;建立C57BL/6小鼠肝细胞癌皮下荷瘤模型,将45只8周龄雌性C57BL/6小鼠(体质量16~20 g)按简单随机分组法分为5组(每组9只):PBS组、PR8组、PD-1抗体组、rOV-IL-21-NS组和rOV-IL-21-NS联合PD-1抗体治疗组,以评价单药和联合疗法抗肿瘤效果;通过流式细胞术评价单药和联合疗法对肿瘤免疫微环境的调控作用。结果利用RG技术成功拯救重组溶瘤流感病毒rOV-IL-21-NS,经测序验证了IL-21成功插入目的序列,其可稳定传代,第6代病毒血凝效价达211,病毒滴度达106 TCID50/mL。rOV-IL-21-NS选择性降低肝癌细胞活力而对正常肝细胞无明显影响。相对于PBS组,rOV-IL-21-NS联合PD-1抗体显著抑制小鼠肿瘤的生长(P<0.001),增加脾脏组织中CD4+CD69+T及CD8+CD69+T细胞的比例(P<0.05)。结论嵌合IL-21的重组溶瘤流感病毒rOV-IL-21-NS可有效、安全地靶向杀伤肝癌细胞,协同PD-1抗体进一步增强T细胞活化,改善免疫微环境。

外源钙对低温胁迫下甜瓜幼苗膜稳定性和渗透调节物质的影响

采用5mmol/L的CaCl2喷施"二叶一心"期甜瓜幼苗后,置于8℃培养箱中培养,并测定24 h内膜稳定性和渗透调节物质变化.结果表明,低温胁迫下,对照组甜瓜幼苗的丙二醛(MDA)含量和膜透性持续上升,可溶性蛋白和可溶性糖含量均在6 h达到最高,游离脯氨酸和有机酸含量则是在3 h达到最大值.钙处理组的MDA含量、膜透性和渗透调节物质含量变化均与对照组相似,但相同时间段内,可显著降低低温胁迫下甜瓜幼苗MDA积累及细胞膜相对透性,提高蛋白质、可溶性糖和游离脯氨酸含量,而对有机酸含量影响不显著.

CDC42与癌症

细胞分裂周期蛋白42(cell division cycle 42,CDC42)是Rho蛋白鸟苷三磷酸酶(guanosine triphosphatase,GTPase)家族成员之一,在细胞增殖、迁移、转化等过程发挥重要作用。与大多数GTPase一样,CDC42的活性受到鸟嘌呤核苷酸转换因子(guanine nucleotide exchange factors,GEF)、GTP酶激活蛋白(GTPase activating proteins,GAP)和鸟苷酸解离抑制因子(guanine nucleotide-dissociation inhibitors,GDI)的调控。目前研究表明,CDC42在大多数人癌症组织中表达异常,对癌症的发生发展具有复杂而重要的调控作用。该文就CDC42自身活性变化、CDC42调节因子的变化及其下游效应因子的变化在癌症中的作用进行综述,旨在深入理解CDC42在人类癌症中的作用机制。

CDC42在HBx介导肝细胞恶性转化中作用的定量蛋白质组学研究

目的寻找在乙肝病毒X蛋白(HBx)诱发肝细胞恶性转化过程中CDC42信号通路发挥作用的介导因子。方法利用基于质量亏损的准等重二甲基标记(p IDL)的定量蛋白质组学方法,检测CDC42基因敲除前后HBx转基因细胞蛋白质组的差异。筛选差异蛋白并对差异蛋白进行基因本体(gene ontology,GO)功能分析。结果与结论共定量到3409个蛋白,筛选出220个差异蛋白,通过GO分析发现与细胞骨架组织相关的palladin、成蛋白样亚家族1(formin-like 1,FMNL1)和角蛋白-19均发生显著下调。该研究为CDC42在HBx介导Huh7细胞恶性转化的机制研究提供了候选基因和蛋白。

核转染技术转染水牛细胞的初步研究

本研究旨在获得一种高效转染水牛细胞的方法。本研究首先以水牛胎儿成纤维细胞(BFF)为研究对象,建立、优化核转染法;随后,比较核转染法、脂质体法、电穿孔法转染BFF的效率;最后选用较优的方法,探讨转染水牛原代骨髓间充质干细胞和类胚胎干细胞的可行性。结果发现随电压的增加,核转染BFF的效率升高;核转染电压为225V,脉冲时间为10ms时,细胞EGFP阳性率为(83.1±1.4)%,转染效率显著高于脂质体法((11.7±1.2)%)和电穿孔法((35.5±2.0)%)。运用优化的核转染条件可以成功将外源基因导入水牛原代骨髓间充质干细胞和类胚胎干细胞,且不影响其细胞生物学特性。本研究为以多能干细胞介导的水牛转基因克隆胚胎的生产奠定了基础。