人硫氧还蛋白还原酶cDNA的克隆及在大肠杆菌中的表达

目的:克隆人硫氧还蛋白还原酶(TR)基因并构建原核表达载体,获得TR蛋白。方法:采用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术,从人胚脑组织中扩增出TR cDNA片段,克隆至pGEM-T载体并转化大肠杆菌DH5α,获得重组质粒pGEM-TR;经序列分析证实后,提取pGEM-TR重组体,由双酶切得到目的片段,并插入pET9c原核表达质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3),获得重组质粒pET-rhTR。异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导pET-rhTR在BL21中表达,用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)及免疫蛋白印迹(Western blot)分析重组蛋白。结果:克隆的TR cDNA与人胎盘组织TR cDNA同源性为99％;pET-rhTR在大肠杆菌中高效表达,目的蛋白占菌体总蛋白量的36％,其分子质量为55 ku。TR cDNA序列被GenBank收录,登录号为AF208018。结论:成功克隆了人脑组织来源的TR基因,该基因在大肠杆菌中得到高表达,为进一步研究其功能奠定基础。

TR基因重组腺病毒载体的构建和鉴定

目的 :构建含人硫氧还蛋白还原酶 (TR)基因的重组腺病毒载体 ,探讨TR的抗氧化功能与神经退行性疾病的相关性。方法 :从重组质粒pGEM TR上用内切酶切下编码 5 0 0个氨基酸的全长TRcDNA片段 ,并连接穿梭质粒pShuttle,再双酶切pShuttle TR。将带有CMV启动子的目的片段 ,插入E1、E3缺失的Adeno X病毒DNA中 ,以Adeno TRDNA通过脂质体转染HEK2 93细胞 ,获得重组腺病毒Adeno TR进行PCR鉴定及病毒滴度测定。用重组腺病毒感染CV1细胞 ,通过免疫荧光染色与Westernblot分别检测重组腺病毒感染的细胞上和裂解液中TR蛋白的表达。结果 :重组腺病毒Adeno TR的病毒滴度为 4 .4× 10 11pfu/L。PCR、荧光显微镜证实 ,以及Westernbolt分析 ,在相对分子质量 (Mr)约 5 5 0 0 0处均出现特异性条带。结论 :成功地构建了重组腺病毒载体 ,并能介导外源基因TR表达 ,为进一步研究TR的功能及其与疾病的相关性奠定了基础。

猪脑硫氧还蛋白还原酶基因片断的序列分析

目的 :在猪脑细胞中分离并克隆硫氧还蛋白还原酶 (TR)基因片段 ,以人脑TR基因片段为参照比较分析 ,探讨选择猪作为研究TR基因功能实验动物模型的可能性。方法 :(1)进行逆转录 -聚合酶链式反应 (RT PCR) ,获得TR基因cDNA ;(2 )插入pGEM T载体 ,转化至大肠杆菌 ;(3)筛选并鉴定阳性克隆 ,纯化重组子并测序 ;(4 )将测序结果与人脑TR基因序列比较。结果 :(1)获得了一个 6 0 6bp大小的猪脑细胞TR基因片段 ,含有 196个氨基酸。(2 )猪脑TR基因片段序列与基因库中的人脑TR基因序列有 88%同源性 ;(3)猪脑TR氨基酸序列中有 18个氨基酸与人脑TR不同 ,同源性为 90 %。结论 :猪与人TR基因的同源性较大 ,选择猪作为研究TR功能的实验动物有一定的可能性。

叠氮钠损伤的神经元内硫氧还蛋白mRNA水平的变化

氧化应激与许多神经退变病有关,而线粒体损伤是氧化应激加剧的重要原因。本文通过细胞活性检测(MTT法)、形态学观察,分析NaN_3对原代培养神经元的损伤作用,并通过RT-PCR半定量检测NaN_3损伤后神经元内疏氧还蛋白(Thioredoxin,Trx)mRNA水平的改变,以阐明这一重要的氧还调节蛋白在神经元损伤过程中的作用。实验表明NaN_3以浓度和时间依赖方式损伤神经元,降低Trx表达水平。提示:神经元内呼吸链受损引起Trx表达减少,从而减弱神经元内氧还调节功能,最终引起神经元损伤、死亡。

EB病毒潜伏期膜蛋白2A重组腺病毒的制备及表达

目的 :构建EB病毒潜伏期膜蛋白 2A重组腺病毒 ,研究EB病毒相关肿瘤治疗性疫苗。方法 :利用RT PCR扩增出EB病毒B95 8株潜伏期膜蛋白 2A(LMP2A)全部编码蛋白的基因 ,并克隆至pGEM T载体中。并将LMP2AcDNA插入E1、E3区替代的腺病毒载体pAX1CW ,选择正确的克隆pAX1CW LMP2A与Ad5DNA 末端肽复合体共转染 2 93细胞 ,通过同源重组获得复制缺陷型的重组腺病毒。提取重组腺病毒转染的 2 93细胞DNA ,通过酶切初步鉴定。选择阳性克隆感染CV1细胞 ,通过流式细胞仪和激光共聚集显微镜分析LMP2A蛋白表达情况。结果 :挑选同源重组 17个克隆中有 9个为阳性克隆 ,扩增到的病毒滴度为 2 3× 10 8pfu/ml。用MOI =10 0的重组腺病毒感染CV1细胞 ,48h后在激光共聚焦显微镜下可见LMP2A蛋白表达于CV1细胞膜上 ,经流式细胞仪检测LMP2A蛋白表达阳性细胞数为 94 4 %。结论 :重组腺病毒能有效地介导LMP2A基因的表达 ,为进一步研究该基因功能及其工程疫苗打下了基础。

爱泼斯坦-巴尔病毒潜伏期膜蛋白2AcDNA的克隆及序列分析

目的 :克隆爱泼斯坦 巴尔病毒 (EBV)潜伏期膜蛋白 2A(LMP2A)基因 ,进一步研究其基因工程疫苗。方法 :用逆转录 聚合酶链反应 (RT PCR)扩增出EBVB95 8株LMP2A全部编码蛋白的基因 ,并克隆至载体pGEM T中 ,通过α 插入失活、PCR及EcoRⅠ、SmaⅠ限制性内切酶双酶切等鉴定重组质粒 ;采用Sanger双脱氧终止法测定cDNA片段的核苷酸序列。结果 :克隆出LMP2A第 1个外显子到第 8个外显子的全部编码蛋白的cDNA ,测序结果与EB病毒B95 8原型株LMP2AcDNA作同源比较 ,完全一致。结论 :本实验克隆了LMP2A基因的全部编码蛋白的cDNA全长片段。

叠氮钠、过氧化氢对SH-SY5Y细胞内硫氧还蛋白还原酶的影响

过度氧化应激是诱发许多神经退变病的重要因素。叠氮钠(NaN3)是线粒体有氧呼吸链细胞色素c氧化酶(COX)的特异性抑制剂,过氧化氢(H2O2)释放氧自由基造成氧化损伤,两者都可以用于氧化应激情况下神经元损伤模型的建立。硫氧还蛋白还原酶(thioredoxin reductase,TR)特异性的还原氧化型的硫氧还蛋白(thioredoxin,TRx),调节细胞中氧化还原的平衡。现以不同浓度NaN3或H2O2处理人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y细胞),建立损伤模型。通过MTT法、形态学方法检测SH-SY5Y细胞损伤程度。同时,通过Western blot定量法、免疫细胞化学法,检测损伤的SH-SY5Y细胞中TR含量的改变,观察TR在胞内的分布。实验表明,NaN3、H2O2均以浓度依赖方式损伤SH-SY5Y细胞;TR分布于SH-SY5Y细胞的胞浆,表明TR是一种分泌蛋白,损伤后分布无明显变化。但一定浓度的NaN3作用后3h,胞内TR水平显著降低,即神经系统内呼吸链受损可抑制TR的表达,为神经退变病的防治提供了新的思路。

重症急性胰腺炎实验动物模型的快速制作和筛选

采用4种激活剂(去氧胆酸钠、牛胆盐、糜蛋白酶、胆汁加狗血)改良的Wakayama方法经杂交狗主胰管注入,制作重症急性胰腺炎实验动物模型.结果显示:用20mmol/L去氧胆酸钠10～15min即可诱导SAP,并可出现胰组织明显的病理学改变.更进一步的胰组织学检查表明,其病理征象与人的SAP相似.

分离与克隆中国人TPO基因片段及序列分析

应用ＲＴＰＣＲ技术从中国人胎肝细胞中分离出１个５６６ｂｐ大小的基因片段，经过克隆、限制性内切酶鉴定和序列分析证实为ＴＰＯ的ｃＤＮＡ片段．与ＧｅｎＢａｎｋ中发表的人ＴＰＯｍＲＮＡ的序列比较同源性在８２％～９９％之间，仅有２个碱基不相同，在１７５位密码子（５２３～５２５位的碱基）分别是ＣＧＧ和ＣＡＡ，即精氨酸（Ｒ）的位置上，中国人是谷胺酰氨（Ｇ）．而与测得的韩国人序列比较。

表达EB病毒潜伏膜蛋白2A(LMP2A)的小鼠移植瘤模型的建立

目的:建立表达EB病毒LMP2A小鼠移植瘤模型,为树突状细胞治疗EB病毒相关肿瘤的动物试验奠定基础。方法:将EB病毒LMP2A基因克隆至逆转录质粒pLXSN中,重组质粒用脂质体Clonfectin转入BALB/c小鼠来源的骨髓瘤细胞SP2/0,经G418筛选获得阳性克隆,亚克隆得到EB病毒LMP2A表达株并经PCR、RT-PCR、IFA、流式细胞仪鉴定。腹股沟皮下接种该细胞入BALB/c小鼠得到移植瘤模型,两周后切除肿瘤组织并作苏木精-伊红(H-E)染色切片。结果:构建出含EB病毒LMP2A基因的重组逆转录质粒,获得表达EB病毒LMP2A的SP2/0细胞,该细胞在BALB/c小鼠可生长成肿块。结论:成功地构建表达EB病毒潜伏膜蛋白2A(LMP2A)的小鼠移植瘤模型。

双歧杆菌微生态制剂的研究和应用现状

双歧杆菌为机体肠道内数量占绝对优势的生理菌，对维持人体健康起着重要作用。文章从双歧杆菌的基础研究、产品开发、保健和药用作用等方面，介绍了双歧杆菌微生态制剂的国内外研究和应用状况。

人脑硫氧还蛋白还原酶基因的克隆及测序

目的:从人脑组织中克隆硫氧还蛋白还原酶基因。方法;从胎脑中提取总RNA,采用RT-PCR技术,获得该基因的cDNA,构建pHBTR重组质粒,通过蓝白斑筛选及限制性内切酶鉴定,选择阳性克隆并测序。结果:测序结果显示该基因的开放读码框为1500 bp,用计算机软件处理后推导出相应的氨基酸序列为500个氨基酸的多肽链,将该基因与人胎盘TR基因比较发现两者的同源性为99％,在核苷酸序列上有5处碱基不同;且在氨基酸序列上也有4处不同。结论:首次获得中国人脑TR基因。

人白细胞硫氧还蛋白还原酶的分子克隆和序列分析

目的:克隆人白细胞硫氧还蛋白还原酶(thioredoxin reductase,TR)编码区的cDNA并进行序列分析。方法:采用RT-PCR方法获得TR基因cDNA,选择阳性克隆并测序。结果:通过分子克隆和序列分析,发现TR基因长1554bp,ORF为1494bp,编码 498个氨基酸。结论:确定了中国人白细胞TR的 cDNA序列,并据此推导出相应的氨基酸序列。

针灸推拿与关节活动相结合治疗新生儿臂丛神经损30例

目的:讨论针灸推拿与关节活动相结合在治疗新生儿臂丛神经损伤中的疗效。方法:采用针灸推拿与关节活动相结合的方法治疗新生儿臂丛神经损伤30例31肢,其中出生后第2天治疗21例22肢;2天至1个月内治疗5例5肢;1个月至6个月内治疗4例4肢。结果:30例中27例28肢治疗后达到完全治愈,其中23例24肢治疗时间为半年,2例2肢治疗时间为1年,2例2肢治疗时间为2年。其余3例3肢治疗3个月后选择手术治疗。结论:针灸推拿与关节活动相结合治疗新生儿臂丛神经损伤,疗效肯定,可作为临床首选的早期治疗方案。

实验性SAP胰细胞酶活性的定位(量)和图象分析

本实验参照Wakayama的方法制作重症急性胰腺炎(SAP)动物模型,并以分子生物学技术.采用图象分析仪,进行胰组织细胞内酶活性定位、定量分析,通过检测发现SAP时胰细胞内细胞色素氧化酶(CCOase)和三磷酸腺苷酶(ATPase)均降低;实验提示:在外科治疗的前提下,用低分子右旋糖酐扩容.改善胰腺血流量,可使SAP时胰细胞酶的活性明显增加.

重症急性胰腺炎血液稀释治疗犬的实验观察

本实验提示:患重症急性胰腺炎(SAP)时,在外科手术的前提下,及早经胰腺局部动脉灌注血管扩张剂和抑酶剂,尤其是用低分子右旋糖酐作为扩容剂,比单纯的晶体扩容复苏更为重要,通过改变其血流,增加胰腺的灌注,从而防止SAP早期局部缺血所至的继发性损伤.

生长抑素对胰源性溃疡血清与胃液胃泌素影响

研究了空腹麻醉犬，经主胰管匀速连续灌注１０ｍｍｏｌ／Ｌ去氧胆酸钠，建立胰源性溃疡的实验模型。经胃灌注生长抑素（１０μｇ／ｋｇ），用放免法测定血清和胃液胃泌素含量。结果显示，用生长抑素组疗效最为理想，各项胃泌素指标趋于正常或平稳。生长抑素治疗组较重症胰腺组间的差异显著（Ｐ＜０．０１）。初步归结其主要机制是药物抑制胃窦Ｇ细胞泌酸，在整体实验条件下，药物的作用结果还受整体调节抑制的较大影响。