氟骨症中成骨细胞损伤机制的研究进展

氟是一种在生物圈内广泛分布的化学性质极其活泼的非金属元素。现代科学认为,微量的氟对生物体的生长、发育以及健康的维系起着不可或缺的促进作用[1],但是由于地质构造、工业污染等客观原因,部分地区居民系统暴露于自然高氟环境,因而患染了一系列慢性全身性疾病,是为地方性氟中毒[1]。我国是世界上地方性氟中毒流行较严重的国家之一[1]。临床研究发现,氟极易在骨组织中蓄积,造成氟骨症[2]。作为地方性氟中毒的基本病症,成骨活跃和骨转换加速是氟骨症进展的根本原因,也是临床表型多样的病理基础[2]。成骨细胞是由间充质干细胞经多种因素共同作用逐渐分化形成的一种分泌细胞,是骨形成的基本功能单位,在骨的生长、发育和骨损伤修复过程中均起到重要作用[2]。

MicroRNA-212-3p与靶基因转化生长因子-β2基因3'UTR的关系研究

目的构建转化生长因子-β2(TGF-β2)基因3'UTR双荧光素酶报告质粒,分析microRNA-212-3p(miR-212-3p)与其潜在靶基因TGF-β2的靶向关系。方法将TGF-β23'UTR片段构建至双荧光素酶报告载体pYr-MirTarget上,随后将重组质粒与miR-212-3p核苷类、无核苷类及其抑制剂共同转染Saos-2细胞(人成骨肉瘤细胞),通过双荧光素酶报告系统检测荧光素酶活性,RT-PCR检测Hsa-miR-212及TGF-β2基因的mRNA相对表达量,Western blotting检测TGF-β2蛋白相对表达量。结果miR-212-3p-mimics+TGF-β23'UTR共转染组荧光素酶活性较对照组低(P<0.05)。miR-212-3p-mimics+TGF-β23'UTR共转染组Has-miR-212 mRNA相对表达量最高,miR-212-3p-inhibitor+TGF-β23'UTR共转染组最低(P<0.05)。miR-212-3p-mimics+TGF-β23'UTR共转染组TGF-β2 mRNA相对表达量最低,miR-212-3p-inhibitor+TGF-β23'UTR共转染组最高(P<0.05)。miR-212-3p-inhibitor+TGF-β23'UTR共转染组TGF-β2蛋白相对表达量最高,miR-212-3p-mimics+TGF-β23'UTR共转染组最低(P<0.05)。结论该实验成功构建了TGF-β2基因3'UTR荧光素酶重组质粒,而且miR-212-3p可以与TGF-β2基因的3'UTR结合,抑制荧光素酶活性,由此推断TGF-β2是miR-212-3p的靶基因。

程序性坏死在氟致人成骨细胞氧化性损伤中的作用

目的探究程序性坏死与氟诱导的人成骨细胞氧化损伤的关系。方法选择人成骨肉瘤细胞系(Saos-2)体外培养,并用不同浓度的氟化钠(0、5、10、20、40 mg/L)干预以建立氟致成骨细胞损伤模型;利用分光光度法测定细胞中T-SOD、GSH、MDA的含量。结果实验组中T-SOD的活力及GSH的含量均低于相同染氟条件下的对照组(P<0.05);T-SOD的活力及GSH的含量随处理浓度的增加而下降,两者存在明显负相关(-1<r<0,P<0.05);干预时间对于细胞中T-SOD的活性和GSH的含量的影响存在双向性,即在氟干预浓度小于20 mg/L时,T-SOD的活力和GSH的含量与干预时间呈正相关,在氟干预浓度大于20 mg/L时,T-SOD的活力及GSH的含量与干预时间呈负相关;实验组中MDA的含量均高于相同染氟条件下的对照组(P<0.05);MDA的含量随着氟诱导浓度的增加而增加,两者存在明显正相关(0<r<1,P<0.05);在实验组中,干预时间对于细胞中MDA的含量的影响存在单向性,细胞中MDA的含量与干预时间呈正相关,而在对照组中,出现了与T-SOD和GSH相反的趋势。结论氟诱导过程中成骨细胞程序性坏死发生与氧化损伤有关。

石河子基因检测技术在多胎肉羊生产上的应用

应用检测多胎基因技术,从石河子本场羊群中筛选出含有纯合多胎基因FecB的小尾寒羊和本场哈萨克羊杂交F1代哈寒与哈萨克纯繁后代进行对照试验。检测结果F1代哈寒平均产羔数1.70只、繁育率160%、成活率94%。且杂交哈寒F1代羔羊生长明显快于哈萨克羔羊。分析结果证明多胎杂交后代具备高产繁殖性能,可以探索建设石河子肉羊高效养殖模式。

氟诱导成骨细胞程序性坏死的实验研究

目的探讨程序性坏死通路受体相互作用蛋白1-受体相互作用蛋白3-混合系列蛋白激酶样结构域(RIP1-RIP3-MLKL)是否参与氟诱导的成骨细胞死亡。方法体外培养人成骨肉瘤细胞株(Saos-2细胞),按如下分组分别处理24、48 h:对照组,氟化钠(NaF)组(5.0、10.0、20.0、40.0 mg/L NaF),程序性坏死抑制剂Necrostatin-1(Nec-1)组(50.0μmol/L Nec-1),NaF+Nec-1组(5.0、10.0、20.0、40.0 mg/L NaF+50.0μmol/L Nec-1),采用CCK-8法检测细胞增殖情况,化学比色法检测细胞上清液乳酸脱氢酶(LDH)活性。为进一步分析NaF对RIP1-RIP3-MLKL通路的影响,将Saos-2细胞分为对照Ⅱ组和NaFⅡ组(2.5、5.0、10.0、20.0、40.0 mg/L NaF),分别处理24、48 h,采用蛋白免疫印迹(Western blot)法检测细胞RIP1、RIP3、MLKL蛋白表达水平。结果各组处理24、48 h时细胞增殖率(%:100.00±0.59、104.90±0.44、104.16±0.41、82.45±1.91、64.59±1.83、103.56±0.41、107.18±0.87、105.35±1.28、89.63±1.20、77.51±1.30,100.00±0.33、107.92±0.44、101.78±1.06、75.45±0.39、57.94±1.17、106.74±0.21、111.85±0.21、107.82±0.68、82.34±0.56、70.19±0.99)比较,差异均有统计学意义(F=77.13、2313.43,P均<0.05)。除10.0 mg/L NaF+Nec-1组处理24 h时细胞增殖率与10.0 mg/L NaF组比较差异无统计学意义(P>0.05)外,其余各浓度NaF+Nec-1组处理24、48 h时细胞增殖率较对应浓度NaF组均显著升高(P均<0.05)。Saos-2细胞增殖率与染氟浓度呈负相关(r24 h=-0.976,r48 h=-0.969,P均<0.001)。与对照组比较,各浓度NaF组处理24、48 h时LDH活性均较高(P均<0.05);且各浓度NaF+Nec-1组处理24、48 h时LDH活性较对应浓度NaF组均显著降低(P均<0.05)。Saos-2细胞LDH活性与染氟浓度呈正相关(r24 h=0.985,r48 h=0.988,P均<0.001)。与对照Ⅱ组比较,5.0 mg/L NaFⅡ组处理24 h时RIP1、RIP3、MLKL蛋白表达水平及处理48 h时RIP3蛋白表达水平均较高;10.0、20.0、40.0 mg/L NaFⅡ组处理24、48 h时RIP1、RIP3、MLKL蛋白表达水平均较高(P均<0.05)。Saos-2细胞RIP1、RIP3、MLKL蛋白表达水平与染氟浓度呈正相关(r24 h-RIP1=0.881,r48 h-RIP1=0.952,r24 h-RIP3=0.867,r48 h-RIP3=0.938,r24 h-MLKL=0.758,r48 h-MLKL=0.907,P均<0.001)。结论氟通过RIP1-RIP3-MLKL通路直接引起成骨细胞程序性坏死,细胞受损的严重程度与染氟浓度密切相关,Nec-1可以部分逆转氟的影响。

PARP-1和氟诱导成骨细胞凋亡的相关性研究

目的探究染氟成骨细胞凋亡与多聚腺苷二磷酸核糖基聚合酶-l(PARP-1)蛋白的相关性;预先探索PARP-1在成骨凋亡过程中的作用,以期在氟骨症治疗中寻找新的靶点。方法采用人成骨肉瘤细胞系(Saos-2)建立体外染氟模型,即经体外细胞培养后分别加入如下浓度梯度氟化钠(NaF,0.0,2.5,5.0,10.0,20.0和40.0 mg/L)处理;在实验组中加入适量Nec-1抑制细胞程序性坏死,再以细胞毒性试验(CCK-8法)观察染氟成骨细胞在各时间点和实验组的细胞存活率;同时利用免疫印记法(Western blot)检测各组PARP-1[poly(ADP-ribose)polymerase-1],Bax(Bcl2-associated X protein)和Bcl-2(B-cell lymphoma-2)的蛋白含量。结果PARP-89 kD与氟浓度呈明显正相关趋势(r24 h=0.924,r48 h=0.927,P<0.01),PARP-113 kD与氟浓度呈明显负相关趋势(r24 h=-0.677,r48 h=-0.785,P<0.01),PARP-89 kD的转化率和氟浓度呈正相关(r=0.772,P<0.01)。氟浓度高于10 mg/L时,随氟浓度的增加Bax/Bcl-2也持续增长(r24 h=0.808,r48 h=0.948,P<0.01);氟浓度在5 mg/L以下时,加入NaF组的细胞存活率始终高于空白对照组,细胞存活率与氟浓度呈明显正相关(P<0.01);当氟浓度超过5 mg/L时,细胞存活率与氟浓度呈明显负相关(P<0.01)。结论提示PARP-1与染氟成骨细胞的凋亡密切相关。