藜科6种耐盐植物遗传多样性的EST-SSR分析

利用EST-SSR标记分析了藜科6种耐盐植物的遗传基础和遗传多样性,以期为藜科耐盐植物遗传育种提供快速、可靠的分子标记辅助选择工具。采用31对藜科海蓬子属和碱蓬属的EST-SSR引物对藜科6种植物进行PCR扩增,其中16对引物得到较好扩增,引物通用率为51.6%,共检测到18个多态性位点,每位点等位基因数2~4个,多态性丰富。进一步采用Nei’s遗传距离聚类分析表明6种植物可以分为3组,主成分分析也支持上述分组,而且DY529957、DY529903和DY5298853个EST在分组中贡献率最高。经与GenBank中序列相似性比对,前两者分别编码生长素抑制蛋白（Auxin-repressed protein,ARP）和植物防御素（Defensins,Def）,都参与植物逆境胁迫响应,但分属于不同代谢途径;后者则编码未知蛋白。总体而言,16对SSR引物在藜科6种植物间具有较好的通用性,能够揭示该6种植物间广泛的遗传多样性,及其存在不同耐盐机制提供分子证据。

盐胁迫下苗期栽培大豆生理响应及Na^+动态平衡关键基因的表达

【目的】研究耐盐栽培大豆和盐敏感栽培大豆对盐胁迫的响应,特别是盐胁迫对大豆幼苗光合特性、离子含量及Na^+动态平衡相关基因表达的影响,通过比较盐胁迫下不同大豆品种的响应差异,揭示不同基因型大豆耐盐机制,为大豆栽培管理、耐盐品种的选育及人工调控提供理论参考。【方法】以耐盐栽培大豆(Y8D6008、Y8D6013)和盐敏感栽培大豆(Y8D6132、Y8D6136)为材料,选取长势一致的大豆幼苗于1/2×Hoagland营养液中培养,待第一片复叶完全展开时,营养液中加入Na Cl,每天递增50 mmol·L^(-1)到达处理浓度150 mmol·L^(-1),处理持续7 d。以不加Na Cl的1/2×Hoagland营养液作为对照,研究盐胁迫下大豆幼苗的光合特性、离子含量及Na^+动态平衡相关基因表达变化。【结果】150 mmol·L^(-1) Na Cl不同程度地抑制了4种大豆幼苗生长,同时显著降低SPAD值、净光合速率、气孔导度和蒸腾速率,但是Na Cl胁迫对盐敏感大豆影响程度显著高于耐盐品种;盐胁迫显著降低耐盐大豆的胞间CO2浓度,而盐敏感大豆与之相反,说明150 mmol·L^(-1) Na Cl处理下气孔限制是引起耐盐品种光合速率下降主要因素,而盐敏感品种光合速率下降主要因素是非气孔限制。对大豆植株的不同离子含量进行测定,发现盐胁迫下4种大豆叶片中Na^+积累均显著升高,盐敏感品种上升幅度显著高于耐盐品种,而K^+含量与Na^+含量的变化规律相反。盐敏感大豆叶片中磷含量(P)均受盐胁迫显著下降,而耐盐大豆叶片P在胁迫后略有增加。相关分析表明净光合速率变化幅度与叶片中Na^+、K^+和P含量变化幅度存在显著的相关性。对6个参与大豆植株体内Na^+动态平衡相关基因Gm SOS1、Gm Ncl1、Gm SALT3、Gm NHX1(离子通道基因)、Gm CIPK1(信号转导基因)和Gm AVP1(能量运输相关基因)相对表达量进行分析,发现盐胁迫后4种大豆的Gm Ncl1表达量均显著上调,盐敏感品种上调倍数高于耐盐大豆品种,这种表达变化与大豆的耐盐性具有一定的关联性,而其他5个基因表达量与大豆的耐盐性没有明显的关联性。【结论】与盐敏感大豆相比,耐盐大豆在盐胁迫环境条件下减少Na^+在叶片中的积累,保持相对较高的K^+和P含量,并维持相对较高的光合速率,这是耐盐大豆比盐敏感大豆具有较强耐盐特性的因素之一,另外Na^+动态平衡相关基因GmNcl1可能与大豆耐盐特性有一定关联性。

65个高粱种质萌芽期的耐盐指标比较及其耐盐性综合评价

为筛选出适合在盐渍土壤中生长的高粱〔Sorghum bicolor(Linn.)Moench〕种质,对10 g·L^(-1)Na Cl胁迫条件下65个高粱种质萌芽期的6项耐盐指标进行比较,并通过相关性分析和主成分分析比较了各指标在耐盐性评价中的作用;在此基础上,通过综合得分排序和聚类分析对供试65个种质的耐盐性进行排序及评价。结果显示:供试65个种质的相对发芽势、相对发芽率、相对根长、相对苗高和相对根冠比变幅较大,分别为0.00%~140.56%、31.61%~124.81%、10.45%~154.30%、12.80%~124.95%和22.09%~380.84%;而相对盐害率变幅较小,仅为-8.27%~22.80%。在6个耐盐指标间,相对苗高与相对发芽率和相对盐害率的相关性以及相对根冠比与相对发芽势、相对发芽率和相对盐害率的相关性均不显著,其余指标间均有显著或极显著相关性。主成分分析中,前2个主成分的累计贡献率为75.121 3%,其中,相对发芽势、相对发芽率和相对盐害率为第1主成分的主要因子,相对苗高为第2主成分的主要因子。供试65个种质耐盐性的综合得分为7.18~65.11;其中,甜选35耐盐性的综合得分最高(65.11),耐盐性排序第一;黑穗芦稷耐盐性的综合得分最低(7.18),耐盐性排序最末。聚类分析结果显示:在欧氏距离5.5处,供试65个种质可被分为7类,其中,第Ⅰ、第Ⅱ和第Ⅲ类共包含12个种质,其中9个为耐盐性排序前9位的种质,属于高耐盐种质;第Ⅳ、第Ⅴ和第Ⅵ类共包含31个种质,属于中等耐盐种质;第Ⅶ类包含22个种质,其中10个为耐盐性排序后10位的种质,属于高盐敏感种质。综合分析结果表明:供试65个高粱种质的耐盐性差异很大,其中,甜选35、Rio、宁甜选10、宁甜选11、甜选107、宁甜选17、甜选148、辽甜8号及盐甜选10等为高耐盐种质,适合在盐渍土壤中生长。此外,耐盐性综合得分排序结果与聚类分析结果基本一致,表明用萌芽期的耐盐指标可以初步评价高粱种质的耐盐性。

大豆转录因子基因GmMYB111的克隆及功能分析

【目的】克隆大豆MYB转录因子基因,进行序列分析和表达模式分析,并对其功能进行鉴定。【方法】通过对盐胁迫相关的数字表达谱(DGEP)数据分析,获得一个MYB转录因子Gm MYB111;以盐胁迫处理的c DNA为模板,利用RT-PCR法分离克隆MYB基因c DNA编码序列;根据Gm MYB111蛋白序列进行同源性搜索,得到与Gm MYB111蛋白序列相似度较高的其他物种的蛋白序列;使用MEGA5.05对Gm MYB111蛋白序列及其同源序列进行多序列比对分析并构建同源物种间系统进化树;利用实时荧光定量PCR方法检测目的基因在大豆中受非生物胁迫诱导表达情况及组织特异性表达情况;利用拟南芥原生质体转化体系分析Gm MYB111的亚细胞定位情况;通过酵母杂交系统检测其转录激活活性以及体外结合活性。【结果】根据前期江苏省农业科学院农业生物技术研究所盐土农业研究室盐胁迫相关的数字表达谱(DGEP)数据获得盐胁迫响应显著上调(27倍)的Gm MYB111,利用RT-PCR方法从栽培大豆根组织中克隆该基因片段,序列比对发现其与已公布的Williams82基因组数据库序列一致,生物信息学分析表明,其编码的氨基酸序列具有MYB类转录因子的共同特征,其N端具有R2、R3两个MYB结构域,同时其C-端还存在一个富含酸性氨基酸的转录激活区;系统进化树分析表明,该基因编码的蛋白与Gm MYB76、Gm MYB12a以及苜蓿Mt MYB61的亲缘关系最近;Gm MYB111在大豆中的表达受高盐、干旱、冷害和ABA诱导表达,实时荧光定量PCR检测结果显示,在高盐和冷害胁迫下,Gm MYB111呈上调表达,在干旱胁迫诱导后呈先上调后下调的表达模式,在ABA诱导下其表达量呈现波动式上调和下调表达;时空表达分析表明,Gm MYB111为组成型表达,在大豆幼苗期和成熟期的表达量相对较强,成熟期的表达量相对较低,从不同组织来看,Gm MYB111在茎、叶和花中表达量最高,在根中表达量相对较低,在豆荚中不表达;亚细胞定位结果显示Gm MYB111定位于细胞核中,为典型的转录因子;酵母杂交系统检测表明,Gm MYB111具有转录激活功能,并且能够与顺式作用元件TAACTG基序相结合。【结论】Gm MYB111为典型的R2R3-MYB转录因子基因,具有转录激活活性及DNA结合活性,在大豆中的表达可能与大豆的非生物胁迫和ABA信号转导途径有关,推测其可能通过调节下游基因的表达来调控大豆对非生物胁迫的应答。

GmCHS8和GmIFS2基因共同决定大豆中异黄酮的积累

大豆异黄酮受多基因控制,采用传统育种方法提高大豆异黄酮含量比较困难。我们之前的研究表明,CHS8基因在异黄酮生物合成过程中发挥着重要作用,但CHS8基因过量表达并不能显著提高异黄酮含量。本研究利用Microarray技术,检测了高异黄酮品种RCATAngra(RCAT)和低异黄酮品种Harovinton(HVNT)的18362基因在种子发育过程中表达水平的变化以及大豆种子中异黄酮累积的趋势,利用RT-PCR证实CHS8和IFS2分别是CHSs和IFSs基因家族中的主要基因;证实CHS8是类苯基丙醇主路径中的主基因,并发现异黄酮支路中的IFS2基因在RCAT和HVNT品种中表达差异亦达到显著水平。进一步利用发根农杆菌转化系统,在大豆上分别过量表达CHS8、IFS2和CHS8+IFS2,前两者异黄酮含量较对照分别提高65.9%和34.4%,但增幅未达显著水平;而后者则提高了82.3%,增幅达极显著水平(P<0.0001),因而证实大豆中异黄酮的积累由CHS8和IFS2基因共同决定。

Cd胁迫对大豆幼苗异黄酮合成关键酶基因表达的影响

为了研究Cd胁迫对大豆异黄酮含量的影响,分析了Cd胁迫下大豆叶片和根系中异黄酮的积累情况,并通过定量PCR方法分析了根系在100μmol/L CdCl2处理不同时间下异黄酮合成途径中相关酶基因表达的变化。结果表明:大豆叶片中的异黄酮含量随着Cd处理浓度的增加而上升,根系中异黄酮含量在100μmol/L CdCl2处理5 d时显著上升;100μmol/L CdCl2处理24 h时,IFS2(异黄酮合酶)、PAL(苯丙氨酸裂解酶)、C4H(肉桂酸-4-羧化酶)、4CL(香豆酸辅酶A连接酶)、CHS(查尔酮合成酶)、CHI(查尔酮异构酶)和CHR(查尔酮还原酶)的表达量明显上升,并与根系中异黄酮含量的积累呈现一致的趋势,表明Cd胁迫下大豆可以通过提高异黄酮合成相关酶的表达来促进异黄酮的积累从而应对Cd胁迫。

高粱不同组织浸提液对小麦幼苗的化感作用

为了给小麦合理轮作倒茬提供参考依据,研究了高粱不同组织的水浸提液对小麦幼苗生长的化感作用。结果表明,高粱秆、穗、叶的水浸提液对小麦幼苗的苗高和根长均有极强的化感作用,浸提液在低浓度时促进小麦生长,高浓度抑制小麦生长,且对根的化感作用大于对地上部的化感作用。高浓度高粱浸提液降低了小麦的根系活力和叶片可溶性蛋白含量,提高了小麦叶片的丙二醛(MDA)含量;小麦叶片的超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)等酶活性均显著下降。综合来看,高粱不同组织水浸提液对小麦的化感作用表现为秆>穗>叶。

新型绿色海水蔬菜海蓬子的研究现状与展望

综述了海蓬子的起源、分布及分类等植物学特性、化学成分及保健价值;人工栽培品种的选育及栽培技术,以及耐盐机理及耐盐基因克隆等方面的最新成就,进一步展望了海蓬子扩大应用的前景及其在耐盐研究中的学术价值。

大豆ZF-HD蛋白家族的全基因组序列特征分析

同源异形盒基因家族的同源域蛋白在植物、动物和真菌发育过程中作为转录因子起着重要的作用[1]。自从1993年Schinder首次发现植物同源结构域（PHD,Plant home-odomain）以来,还发现在拟南芥蛋白HAT3.1和HOXIA内含有一段富含半胱氨酸的保守序列,此序列与金属离子结合结构域（Metal-binding domains）非常相似[2]。

5个大豆AT-hook基因GmAHLs的克隆与定位分析

从大豆[Glycine max(Linn.)Merr.]中克隆出5个AT-hook基因,分别命名为GmAHL1、GmAHL2、GmAHL3、GmAHL4和GmAHL5,其中,GmAHL5为GmAHL1的重复基因。序列分析结果表明:5个GmAHLs蛋白的AT-hook基序分别位于其氨基酸序列的42~54、39~51、42~54、41~53及42~54处,且GmAHL1和GmAHL5蛋白的氨基酸序列相同。大豆GmAHLs蛋白和野大豆(G.soja Sieb.et Zucc.)Gs AHLs蛋白与其他植物H1组蛋白的亲缘关系较远,说明GmAHLs蛋白不属于H1组蛋白。GmAHL1基因在所有检测的组织中均不表达;GmAHL2基因主要在花、种子、叶片和根中表达;GmAHL3基因主要在花、叶片、茎和根尖分生组织中表达,在果荚中不表达,但在根瘤中有表达;GmAHL4基因在根瘤中高度表达,在根、茎端分生组织、茎和果荚中也有较高表达;GmAHL5基因主要在叶片、种子、根尖分生组织和花中表达。GmAHL2基因在根中的表达受氨的诱导,GmAHL3基因在根中的表达受硝酸盐、尿素和根瘤菌的抑制。亚细胞定位分析结果表明:大豆GmAHLs蛋白定位于细胞核。研究结果显示:大豆GmAHLs基因均非组成型表达基因,其中GmAHL2、GmAHL3和GmAHL4基因的表达具有特异性,且可被外源氮素和根瘤菌处理诱导或抑制。

大豆GmNAC8基因克隆与原核表达

为了进一步明确GmNAC8基因的功能,设计带有Nde I和Xba I双酶切位点引物,从大豆根系cDNA中克隆到GmNAC8基因全长ORF(Open reading frame),编码蛋白质分子质量为37 000,理论等电点为6.43。将扩增片段克隆至原核表达载体pCZN1,构建重组质粒pCZN1-GmNAC8,经过酶切和PCR验证,并转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,0.2 mmol/L IPTG诱导后,经SDS-PAGE电泳检测获得了目的蛋白质,该蛋白质主要以包涵体的形式存在,通过镍柱子纯化获得纯化蛋白质,然后利用His标签蛋白质作为抗体进行Western-blot分析,证明所纯化蛋白质为目的蛋白质。

海蓬子属植物EST序列的SSR信息分析与标记开发

为明确海蓬子EST序列中SSR的总体特征,开发海蓬子EST-SSR引物,从NCBI网站下载海蓬子及其近缘植物EST序列,利用Cross match等软件过滤掉载体序列、polyA/T和过短或过长的低质量序列,经CAP3软件拼接后获得非冗余EST,然后用在线软件SSRIT从这些序列中查找SSR,采用primer5.0软件设计SSR引物,并进行PCR扩增,对引物适用性进行评价。结果表明,截止2013年5月,NCBI数据库共有海蓬子相关EST序列1 439条,经软件处理后获得无冗余EST序列1 139条,总长542 084 bp,从这些序列中搜索到210个SSR,分布于167条EST中,出现频率为14.66%。SSR平均分布距离为2.58 kb,平均长度为14.56 bp;三核苷酸重复是主导类型,占ESTSSRs总数的40.95%,其次为四核苷酸和五核苷酸重复,分别占29.52%和13.33%;二核苷酸占11.90%,六核苷酸最少,仅占4.29%。在所有类型的重复基元中,ACT/AGT类型最多,占10.95%,其次为AAT/ATT和ACG/CGT,分别占8.10%和6.67%。随机挑选了30个SSR位点,根据其两侧保守序列,设计并合成了相应的EST-SSR引物,对海蓬子DNA进行PCR检测分析,结果有14对引物获得了清晰的条带,进一步将其中的5对引物对10个样本小群体进行了验证,结果显示有较好的多态性。该研究结果表明海蓬子EST序列中含有高频率的SSR位点,ESTSSR标记开发效率较高,为进一步开展海蓬子分子标记研究提供了一批适用的EST-SSR引物。

大豆高盐胁迫下根部组织酵母双杂交文库的构建与分析

为了高效研究大豆耐非生物胁迫的分子调控网络,运用SMART(Switching Mechanism at 5'End of the RNA Transcript)与DSN(Duplex-Specific Nulease)相结合的技术构建了栽培大豆高盐胁迫下根部组织的酵母双杂交cDNA文库。提取高质量的总RNA,利用Oligo(dT)_(16)引物反转录合成cDNA后,经DSN处理,然后利用Advantage 2聚合酶进行长片段PCR扩增,电泳检测显示,产物均一,无高丰度条带,片段范围在0.75~5.00 kb;RT-PCR结果显示,GmActin基因在均一化后表达明显降低,表明均一化效果较好;最后通过SMART同源重组交换技术在酵母菌株Y18 7中构建了酵母双杂交所需的cDNA文库。文库质量检测结果表明:cDNA文库的总独立克隆数为5.61×10~6 cfu、文库滴度为3.4×10^(10)cfu/mL、重组率大于90%、插人片段长度为0.5~3.0 kb,主要集中在1.0 kb左右。

大豆转录因子GmMYB52的克隆、表达及结合功能分析

MYB类转录因子在植物的生长发育和逆境响应中有重要的调控作用。依据课题组前期获得的盐胁迫相关的数字表达谱(DGEP)数据,获得盐胁迫响应显著上调基因GmMYB52,利用RT-PCR方法从栽培大豆(Williams 82)中克隆该基因片段,并与已公布的Williams 82基因组数据库序列比对,该基因与GmMYB52序列一致。生物信息学分析表明,GmMYB52编码区(CDS)全长1083 bp,编码360个氨基酸。其编码的氨基酸序列具有MYB类转录因子的共同特征,其距N端110~160氨基酸残基处有MYB结构域;系统进化树分析表明,该基因编码的蛋白与GmMYB62、拟南芥AtMYBSt1、苜蓿Mt MYB52、水稻Os MYBS3及木豆Cc MYB-like protein J的亲缘关系最近;实时荧光定量PCR结果表明,大豆根部GmMYB52的转录水平受外界非生物逆境的调控,用脱落酸(ABA)和低温(4℃)处理后12 h明显上调,用氯化钠和PEG处理0.5~24.0 h后检测到GmMYB52的转录水平在50%~600%区间内呈现出先上调后下调再上调的趋势。GmMYB52为组成型表达,在大豆的幼苗期和开花期表达较多,在成熟期表达相对较低。GmMYB52在茎叶与开花期的花中表达较强,在根的表达较弱,而在成熟期的豆荚中几乎不表达。亚细胞定位的结果表明,GmMYB52定位于细胞核,符合典型转录因子的定位特征。酵母杂交系统检测表明,GmMYB52具有转录激活特征,并且能够与MYB相关顺式作用元件基序相结合。本研究结果表明,GmMYB52编码典型的MYB转录因子,具有转录激活活性及DNA结合活性,在大豆中的表达可能与大豆的非生物胁迫和ABA信号转导途径有关,推测其可能参与了大豆对非生物胁迫的响应。

沿海滩涂油葵种植与鸟害调查分析

对油葵不同生育期、周边环境以及盘面形状、曲度、直径等籽盘性状与鸟害的关系进行了统计分析。结果表明:在油葵全生育期中,鸟害对油葵的危害以籽实成熟后到采收期间最为突出和严重,对产量造成的损失为11.19%,其中以麻雀为主;周边环境与鸟害程度紧密相关,靠近雀鸟栖息地的地带是鸟害最为严重的区域,产量损失高达29.43%,远高于同一地块旁侧区域,从栖居地到田块最近的直线是雀鸟取食的主路径,因反复取食而危害最重;外翻型的籽盘受雀鸟危害最重,达20.91%,平整型和内收型的籽盘鸟害损失较轻,与前者相比存在显著性差异;盘面曲度小于45 mm时,鸟害损失明显降低。综合分析认为,沿海滩涂种植油葵应在葵盘背部发黄时及时采收,种植场地应选择宽阔、远离茂密树林的地块。

一个大豆ERF转录因子的克隆与表达分析

利用RT-PCR方法从聚乙二醇(PEG)处理的大豆根部组织中克隆了1个大豆乙烯响应因子(ERF)基因,由于其位于大豆基因组第7染色体上,故命名为GmERF7,基因座为Glyma07g02930。序列分析结果表明:该基因含有1个237 bp长的内含子,开放阅读框(ORF)长585 bp,编码194个氨基酸,蛋白质分子量为2.199×104,理论等电点为7.06;通过氨基酸序列比对发现,该序列与其他物种ERF类蛋白质氨基酸序列有很高的相似性;聚类分析结果表明,GmERF7与苜蓿和蓖麻遗传距离最近,与拟南芥和葡萄遗传距离相对较远;半定量RT-PCR分析结果表明该基因主要在大豆叶和豆荚中表达,而且在外源20%PEG处理不同时间后,该基因的表达在根部组织和叶片组织都受到不同程度的诱导,暗示该基因可能对提高植物耐旱性具有一定作用;利用洋葱表皮细胞的亚细胞定位分析结果表明,该蛋白质位于细胞核内,当去除N端信号肽之后,该蛋白质分布于细胞膜部位,这表明该蛋白质在植物体内通过充当转录因子的作用来调节下游基因的表达;适时定量-PCR(Real-time PCR)分析结果证实,该基因在外源ABA处理后呈现先下调后上调又下降的趋势,表明该基因受ABA的诱导,可能参与了ABA依赖的植物抗逆信号转导途径。

大豆GmTIP1；1基因的克隆与表达分析

利用RT-PCR方法从大豆根部组织获得Glyma03g34310.1开放阅读框(ORF)全长,经测序验证、Blast比对与同源性分析发现该序列编码的蛋白质与其他植物的TIP1;1蛋白具有较高的相似性,故命名为GmTIP1;1基因(GenBank登录号为AK285481),该基因ORF长753bp,编码1个包含250个氨基酸的蛋白,在ORF内部第381个核苷酸处含有1个94bp的内含子,符合↓GT--AG↓的剪接方式;系统进化树分析发现GmTIP1;1聚类到豆科植物分支,其他不同科的植物也有规律地聚到了不同分支,推测该蛋白氨基酸序列可以作为植物分类的依据之一;半定量RT-PCR结果表明该基因在大豆的不同器官、不同器官的不同发育阶段均具较高且同等的表达水平,暗示该基因在植物的整个发育进程中均具重要作用;在盐胁迫的不同时间点其表达量有下降的趋势,但仍然保持较高的表达水平;以pYES2为酵母表达载体,转化酿酒酵母INVSc1菌株,获得重组酵母INVSc1(pYES2-GmTIP1;1),转化菌株在盐胁迫下的存活率明显高于对照INVSc1(pYES2),而在干旱胁迫下则没有显著差异,表明该基因的表达能有效地提高酵母的耐盐性。

大豆GmNAC73-like基因的克隆和表达及其对GmIFS2基因的影响

为研究NAC转录因子对大豆〔Glycine max(Linn.)Merr.〕异黄酮合成的影响,根据大豆基因组序列设计引物,从豆荚中克隆获得Gm NAC73-like基因,并对该基因序列进行生物信息学分析。结果显示:Gm NAC73-like基因包含1个长度981 bp的完整开放阅读框,编码326个氨基酸。Gm NAC73-like蛋白的理论相对分子质量37 000,理论等电点p I 6.4,为亲水性蛋白,无信号肽,并被定位在细胞核上,包含核定位信号"PKRRK"。同源性比对结果显示:Gm NAC73-like蛋白与野大豆(Glycine soja Sieb.et Zucc.)、蒺藜苜蓿(Medicago truncatula Gaertn.)、可可(Theobroma cacao Linn.)、葡萄(Vitis vinifera Linn.)及拟南芥〔Arabidopsis thaliana(Linn.)Heynh.〕的NAC蛋白具有较高的相似性,相似度分别为93%、69%、73%、75%和58%。在NJ系统树上,Gm NAC73-like蛋白与野大豆的Gs NAC8蛋白和木豆〔Cajanus cajan(Linn.)Millsp.〕的Cc NAC8蛋白聚在一起,显示出较近的亲缘关系。半定量RT-PCR分析结果显示:在大豆的三叶期、开花期和结荚期,Gm NAC73-like基因在根中均不表达,在茎和叶中可不同程度表达且茎中表达量较高;而在开花期或结荚期,该基因在花或豆荚中也可表达,且豆荚中表达量较高。酵母单杂交实验结果显示:Gm NAC73-like可与异黄酮生物合成关键酶基因Gm IFS2启动子中的CGTG基序结合;在大豆转基因发状根系中过表达Gm NAC73-like基因后,除查尔酮异构酶基因的表达量无变化外,其他异黄酮生物合成相关基因的表达量均不同程度提高,其中,肉桂酸-4-羟化酶基因和查尔酮合酶基因的表达量明显提高。此外,在Gm NAC73-like基因过表达的大豆转基因发状根系中总异黄酮含量显著降低。综合分析结果表明:Gm NAC73-like可能通过与MYB转录因子的互作调控Gm IFS2基因的表达,并在大豆异黄酮的生物合成过程中起负调控作用。

一个大豆GmXIP基因的克隆与表达分析

XIP(X Intrinsic Protein)亚家族蛋白作为水通道蛋白AQP(Aquaporin)的一个成员,最近在不同植物的基因组或表达序列标签(EST)文库中被鉴定出来。从前期通过Perl程序下载的大豆全基因组水通道蛋白序列中鉴定了一个大豆GmXIP基因,该基因含有一个长385 bp的内含子,且剪接方式是AG/AG,不同于植物普通的GT/AG剪接模式;与其他植物的XIP蛋白的氨基酸序列比对发现该蛋白也具有6个跨膜区,但MIP(Major Instrinsic Protein)家族蛋白保守的"NPA"基序突变为"NPI"和"SPA",暗示该蛋白负责的物质运输与其他植物XIP功能不同;半定量RT-PCR结果表明,该基因在叶和荚表达较弱外,在茎和叶部位的表达较强,而且随着植株的发育,在茎中的表达渐强,叶中则一直保持较高的表达,这表明该基因在营养物质的运输和供给过程中起着关键作用;同时根部组织在盐胁迫8 h时该基因表达达到了顶点,36 h时恢复到处理前的表达水平;利用发根农杆菌注射获得过表达GmXIP组合植株于干旱和盐胁迫处理后发现,该基因过表达后植株抵抗外界非生物胁迫的耐性大大降低,这暗示该基因的过表达可能增进了植物细胞的失水速度,导致植株死亡。这些研究为明确大豆XIP基因的结构和功能提供了理论支持和技术指导。

大豆转录因子GmbZIP60对非生物胁迫的表达模式分析

bZIP基因在植物响应非生物胁迫过程中发挥重要的调控作用。前期试验已经从大豆中克隆到一个b ZIP基因Gmb ZIP60(Genebank Accession No:DQ787038),并成功转化到拟南芥中。本研究在此基础上,利用q RT-PCR和GUS组织化学染色法研究了高温(37℃)、低温(4℃)、干旱(PEG6000)、NaCl(200 mmol·L^(-1))和ABA(100 mg·L^(-1))处理对Gmb ZIP60表达的影响。结果表明:高温、低温、干旱和Na Cl胁迫处理下,Gmb ZIP60表达量显著降低,分别变为对照组的0.07,0.25,0.36和0.13倍,而ABA处理对Gmb ZIP60表达量影响不显著,GUS染色结果与荧光定量PCR结果一致。研究认为,Gmb ZIP60可能以负调控的方式参与大豆抗高盐、干旱、高温、低温等非生物胁迫的应答反应。本研究为进一步鉴定和克隆大豆逆境应答关键基因、揭示大豆抗逆分子机制和大豆抗逆性基因工程改良提供了有益借鉴。