HES1在小梁网细胞中作用的初步研究

目的:利用慢病毒包装系统使人眼小梁网细胞(HTMCs)稳定表达HES1 sh RNA并初步探索HES1在HTMCs的作用。方法:体外培养HTMCs和HEK293FT细胞并进行传代,同时应用p LKO.1-puro sh RNA慢病毒载体构建HES1 sh RNA质粒。Lipofectamine 2000慢病毒包装法感染原代HTMCs,使其稳定表达HES1sh RNA/Scramble质粒。采用q-PCR和Western blot方法检测HES1sh RNA的敲低效果及促纤维化细胞外基质蛋白(ECM)的表达变化;HTMCs增殖和迁移能力分别通过CCK-8细胞活性分析和Transwell计数实验进行分析。结果:原代细胞经过培养后贴壁生长,呈长梭形,生长状态良好,形态符合HTMCs形态学特征。HES1 sh RNA有效下调HES1的m RNA和蛋白水平表达(P<0.05)。同时,HES1 sh RNA组促纤维化ECM(FN;COL1;α-SMA)的m RNA和蛋白表达水平较Scramble组显著降低(P<0.05)。而Transwell计数实验显示HES1 sh RNA组HTMCs的迁移数量较Scramble组增加(P<0.05);CCK-8细胞活性分析实验表明抑制HES1表达对HTMCs的增殖活性影响不大,差异不具有统计学意义(P>0.05)。结论:成功建立了稳定表达HES1 sh RNA的HTMCs细胞株。HES1可以影响HTMCs中促纤维ECM的生成及HTMCs的增殖和迁移能力。

白藜芦醇对H2O2及TGF-β2诱导人小梁网细胞的影响及机制探讨

目的观察过氧化氢（H2O2）及转化生长因子（TGF）-β2诱导人小梁网细胞（HTMCs）后对纤维连接蛋白（FN）、胶原蛋白1型（COL1）、核因子（NF）-κBP65蛋白和白细胞介素（IL）-1β基因表达的影响及白藜芦醇（RSV）的干预作用。方法（1）选取汇合度70%～80%的HTMCs分为5组。实验组于无血清培养基中分别加入浓度为150、300、450、800μmol/L的H2O2处理，对照组的培养基中不加H2O2。Westernblot法检测各组FN、COL1、NF-κBP65、NF-κBP65磷酸化（P-NF-κBP65）蛋白的表达，实时定量PCR法检测IL-1β基因的表达。（2）HTMCs细胞分为3组。对照组以不含H2O2及RSV的无血清培基处理，H2O2组以300μmol/L的H2O2处理，H2O2+RSV组同时加入300μmol/L的H2O2及25μmol/L的RSV处理。检测各组上述蛋白和基因的表达情况。免疫荧光检测各组NF-κBP65在HTMCs中的定位。（3）HTMCs细胞分为3组。对照组以不含TGF-β2及RSV的无血清培基处理，TGF-β2组以5μg/L的TGF-β2处理，TGF-β2+RSV组为同时加入5μg/L的TGF-β2及25μmol/L的RSV处理。检测各组上述蛋白和基因的表达情况。结果（1）与对照组比较，150、300、450、800μmol/L组FN和P-NF-κBP65蛋白表达水平均增高，300、450、800μmol/L组COL1蛋白和IL-1β基因表达水平增高（P<0.05），其他指标比较差异均无统计学意义。（2）H2O2组较对照组FN、COL1、P-NF-κBP65蛋白和IL-1β基因表达水平均增高，而H2O2+RSV组较H2O2组上述指标均降低，H2O2+RSV组较对照组仅IL-1β降低（P<0.05）。对照组仅细胞质表达NF-κBP65，H2O2组细胞胞质及核中均有NF-κBP65表达，且核中表达较多；H2O2+RSV组细胞胞质中表达NF-κBP65较核中多。（3）TGF-β2组较对照组FN、COL1、P-NF-κBP65的蛋白和IL-1β基因水平表达均增高（P<0.05），TGF-β2+RSV组较TGF-β2组上述指标均降低（P<0.05）。结论H2O2和TGF-β2能上调HTMCs的FN、COL1、P-NF-κBP65蛋白及IL-1β基因的表达，可能参与青光眼的发生发展过程。RSV能抑制H2O2和TGF-β2对HTMCs的影响，对青光眼发挥一定的保护作用。