猪细小病毒NS1蛋白65-133位氨基酸缺失对其核定位的影响

为了探究猪细小病毒NS1蛋白入核机制,通过生物信息学网站预测PPV NS1核定位序列,根据GenBank上传的PPV非结构蛋白NS1的序列设计NS1扩增引物和一系列重叠PCR引物,以河南省动物性食品安全重点实验室保存的猪细小病毒DNA为模板,扩增NS1和缺失突变体基因,构建真核表达重组质粒pCAGGS-HA-NS1、pCAGGS-HA-NS165-133aaDel、pCAGGS-HA-NS1207-267aaDel。将其转染至PPV易感猪源细胞系PK-15细胞,通过免疫荧光和Western-blot鉴定NS1和不同的NS1缺失突变体在细胞内的核定位情况。结果表明,pCAGGS-HA-NS1、pCAGGS-HA-NS165-133aaDel、pCAGGS-HA-NS1207-267aaDel编码蛋白均成功表达。免疫荧光和Western-blot显示NS1和NS1207-267aaDel蛋白定位于细胞核,而NS165-133aaDel蛋白的细胞定位较NS1发生改变,由细胞核定位改变为细胞质定位,说明PPV NS1蛋白65-133位氨基酸缺失能改变其在细胞内的核定位,PPV NS1蛋白核定位序列NLS存在于NS1的65-133aa处。

细胞自噬在冠状病毒感染中作用机制的研究进展

细胞自噬在病毒感染和致病过程中具有重要作用。针对目前冠状病毒在全世界传播尤其是严重急性呼吸综合征冠状病毒2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)引发的新型冠状病毒肺炎(coronavirus disease 2019,COVID-19)危害人类健康的现状,综述了冠状病毒和细胞自噬的研究进展,分析了细胞自噬与病毒感染之间的关系,包括细胞自噬抑制及促进病毒感染的作用,重点探讨了冠状病毒诱导细胞发生自噬、细胞自噬影响冠状病毒的复制以及冠状病毒调控细胞自噬的分子作用机制3个方面,最后对靶向细胞自噬防控冠状病毒的感染与传播进行了展望,不仅有助于了解冠状病毒的致病机制,而且为抗病毒药物和疫苗的研发提供理论基础,从而为冠状病毒的防控提供新思路。

猪细小病毒非结构蛋白NS1通过NF-κB信号通路介导炎症反应

为了探究猪细小病毒(porcine parvovirus,PPV)非结构蛋白NS1介导炎症反应的情况,将PPV NS1重组质粒转染至PK-15细胞,应用实时荧光定量PCR和免疫印迹技术分别检测炎性因子IL-6/TNF-α的表达和NF-κB信号通路相关蛋白的激活。结果显示,PPV NS1极显著诱导IL-6和TNF-α mRNA的表达(P<0.01)。PPV NS1可显著促进IκBα的降解、p65的磷酸化来激活NF-κB信号通路(0.01<P<0.05)。此外,PPV NS1还促进了Toll样受体2(toll-like receptor 2,TLR2)的表达,TLR2的激动剂和抑制剂分别极显著激活或抑制PPV NS1诱导的IL-6和TNF-α的表达(P<0.01)。结果表明,PPV NS1通过TLR2激活NF-κB信号通路上调炎性细胞因子IL-6和TNF-α的表达。

新型猪α干扰素YNS突变体的构建及其抗病毒活性检测

试验旨在获得高活性的猪α干扰素(porcine interferon alpha,PoIFN-α)。利用融合PCR方法将天然猪α干扰素基因进行定点突变,突变位点为58H(CAT)→Y(TAC)、59E(GAG)→N(AAC)及61L(CTC)→S(AGC)。将突变基因克隆到pET-32a载体上,转化至大肠杆菌Rosetta中诱导表达和鉴定,利用MTT法检测猪α干扰素对Vero细胞的抗增殖能力,利用Vero/VSV系统上测定其抗病毒活性。结果显示,重组蛋白表达形式为包涵体,蛋白分子质量约33 kDa,纯化后猪α干扰素YNS突变体蛋白的CC50为462.7μg/mL,其抗病毒活性为1.63×10^6 IU/mg,相比天然干扰素蛋白活性提高。本研究成功构建了高效猪α干扰素YNS突变体,为干扰素的临床应用提供理论基础。