一种新的基因芯片检测荧光标记技术:通用引物U_2联合标记法

目的报告一种新的基因芯片荧光标记技术:通用引物U2联合标记技术(universal primer U2 labeling ,UPL);比较UPL与随机引物等其他标记方法的效率和可重复性。方法流感病毒RNA用四种标记方法处理后与流感病毒寡核苷酸检测芯片杂交,用Spss10.0对杂交结果进行分析。结果UPL方法在标记物杂交的荧光强度、信噪比、探针真阳性率和可重复性等方面均高于随机引物逆转录掺入标记法,而与其他两种RD标记方法相当,但标记过程相对更加简单。结论UPL方法可用于基因芯片研究和应用。

血管内皮细胞损伤在脓毒症大鼠心肌损伤中的作用

目的探讨血管内皮细胞损伤与脓毒症心肌损伤之间的关系。方法将30只大鼠随机分为假手术组、脓毒症组和乌司他丁组,分别用酶联免疫法吸附法检测血浆中血管性血友病因子(vWF)、血栓调节素(TM)浓度,罗氏生化仪检测血浆肌酸激酶(CK)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)水平,心导管检测心脏左心室压力(LVP)、左心室压力上升或下降最大速率(+dp/dtmax或-dp/dtmax)来评价心功能,用免疫印迹法检测心肌脑利钠肽(BNP)水平来评价心肌损伤情况。结果脓毒症组vWF、TM浓度较假手术组明显增加,同时伴有以CK、CK-MB升高为标志的心肌损伤加重,以及BNP表达增加和LVP、+dp/dtmax、-dp/dtmax的降低为标志的心功能下降,乌司他丁组内皮细胞损伤降低,心肌损伤减轻以及心功能改善。结论内皮细胞损伤可能是脓毒症引起心肌损伤的重要原因。

GFP质控芯片的初步研究

目的:建立一种质量控制芯片来监测样品标记、杂交和检测过程中的失误。方法:针对GFP基因设计的4条60mer寡核苷酸探针和1条阳性对照探针poly(U)与流感寡核苷酸探针一起打印在DAKO玻片上,并构建了GFP基因的克隆载体和体外表达载体,将从这两种重组载体上获得的绿色荧光蛋白(GreenFluorescentProtein,GFP)基因的RNA、DNA片段和人的全血样品中的DNA用限制性显示技术(RestrictionDisplaytechnology,RD)扩增标记,将标记的样品和荧光标记的通用引物U分别与芯片杂交、检测,并对扫描的结果进行统计分析。结果:GFP探针与相应的样品杂交时出现阳性信号,阳性对照探针在所有的杂交中均出现阳性信号,而空白对照则未检测荧光信号。结论:建立的质控芯片具有较好的敏感性和特异性,可以用于基因芯片中的质量监控。

三种寡核苷酸芯片片基的比较

将荧光标记的寡核苷酸打印在Corning、多聚赖氨酸包被的DAKO玻片和多聚赖氨酸处理的一种显微镜载玻片上,并按常规方法进行洗脱,通过GenePix4100A扫描并以Genepix6.0软件分析点的大小、荧光强度和背景荧光强度来衡量3种片基的均一性和固定效率,并通过不同浓度梯度的60bp寡核苷酸探针的杂交实验来衡量片基对杂交效率的影响.结果显示,3种片基的均一性都较好,而多聚赖氨酸包被的DAKO和Corn-ing芯片的固定效率和杂交效率优于国产芯片.

MAPKs家族在中暑小鼠肺微血管内皮细胞凋亡中的作用及机制研究

目的研究丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs)活化对热打击致小鼠肺微血管内皮细胞(PMVECs)凋亡的影响。方法建立重症中暑小鼠模型,采用TUNEL染色及免疫组化检测肺组织损伤情况。二次磁珠分选法分离乳鼠PMVECs,TUNEL染色检测PMVECs凋亡情况,Western blotting检测热打击恢复期(0、2、6h)MAPKs家族活化情况。通过检测单层内皮细胞跨膜电阻(TEER)及辣根过氧化物酶(HRP)值观察不同热打击温度对单层细胞通透性的影响,同时使用MAPKs家族抑制剂检测热打击对单层细胞通透性及凋亡的影响。结果在重症中暑小鼠恢复期肺组织中可观察到PMVECs发生凋亡。TUNEL染色发现随着恢复期时间的延长,PMVECs凋亡数目增多,热打击可使PMVECs MAPKs家族活化且微血管通透性增加,给予p38活化抑制剂SB203580及ERK活化抑制剂PD98059预处理后细胞通透性增加,凋亡数目增多,而给予JNK抑制剂SP600125预处理后细胞则出现相反的变化。结论重症中暑小鼠PMVECs可发生凋亡,p38及ERK起着抗凋亡的作用,JNK起着促凋亡的作用。

微机横联差动电流方向保护装置

系统地介绍了新研制的微机横联差动电流方向保护装置 ,着重介绍横联差动保护的原理及其相继动作区、单回线运行时防止横联差动保护误动的措施等 ,同时介绍了装置的后备保护、重合闸及辅助保护功能 。

血液滤过联合乌司他丁治疗脓毒性休克的分子机制

目的研究血液滤过联合乌司他丁治疗脓毒性休克的分子机制。方法分别取正常人血清、脓毒性休克常规治疗患者血清、脓毒性休克血液滤过联合乌司他丁治疗(CVVH-ULI)患者血清刺激人脐静脉内皮细胞,用FITC标记的白蛋白检测血管内皮细胞通透性,用罗丹明-鬼笔环肽染色检测聚合丝状肌动蛋白(F-actin)形态改变,并检测p38的磷酸化。用p38抑制剂和DMSO预处理内皮细胞,再用脓毒性休克常规治疗患者血清刺激内皮细胞,观察其对内皮细胞通透性及F-actin形态的影响。结果脓毒性休克常规治疗患者血清处理内皮细胞可使其通透性增高,F-actin重排以及p38磷酸化增加,上述变化可被CVVHULI所抑制。p38抑制剂可以抑制脓毒性休克常规治疗患者血清所诱导的内皮细胞通透性增高和F-actin重排。结论 CVVHULI可通过抑制p38活化,进而抑制F-actin重排来降低脓毒性休克所诱发的血管内皮细胞高通透性。

乙型脑炎病毒寡核苷酸基因芯片研究

目的:制备检测乙型脑炎病毒寡核苷酸(oligo)基因芯片。方法:应用生物信息学软件设计60-meroligo探针用于制备基因芯片,乙型脑炎病毒(JEV)基因片段经限制性显示技术扩增标记,用于芯片杂交,清洗和干燥后对芯片进行扫描和数据分析。结果:大部分oligo探针都能特异性与相应样品杂交,呈现阳性荧光信号,而阴性对照和空白对照则基本不能检测到荧光信号。结论:实验中建立的oligo基因芯片检测病原体方法可行,具有应用于临床诊断的前景。

黄热病病毒检测基因芯片的研究制备

目的制备黄热病病毒寡核苷酸检测芯片。方法根据黄热病病毒基因组序列,并应用生物信息学软件设计出22条寡核苷酸探针用于制备基因芯片。克隆于质粒上的黄热病病毒全长基因经限制性显示技术完成扩增并标记,杂交清洗后对芯片进行扫描和数据分析。结果大部分黄热病病毒寡核苷酸探针检测出阳性信号,阴性对照和空白对照检出阴性信号。结论基因芯片技术为黄热病病毒检测提供了一种早期、快速、可靠的方法。

CML患者骨髓单个核细胞基因表达谱分析

目的探讨慢性髓细胞性白血病(CML)的基因表达变化。方法分别从正常人和CML患者骨髓样品中抽取骨髓单个核细胞,分离出cDNA片段,然后再逆转录成cRNA并标记后,与人的全基因组表达谱芯片杂交,ABI1700芯片分析系统进行分析基因表达谱的差异。结果总共发现差异表达的基因有6706个,其中与CML相关的差异基因有75个(上调19个,下调56个)。结论全基因组寡核苷酸基因芯片在分析基因表达谱差异研究中具有广泛的应用价值。

合并伤对重型颅脑损伤患者近期预后的影响分析

目的探讨合并伤对重型颅脑损伤患者近期预后的影响。方法收集153例重型颅脑损伤合并多发伤患者的临床资料,依据患者伤后第28天或出院时GOS分为预后良好组(GOS4～5分)与预后差组(GOS1～3分),比较两组患者合并伤类型的差异性,对可能影响患者近期预后的因素进行单因素分析与Logistic多因素回归分析。结果单因素分析发现合并多发损伤、创伤性/失血性休克、颈椎损伤、胸部损伤、骨盆骨折、四肢骨折及创伤严重程度评分与重型颅脑损伤患者预后明显相关(P<0.05);logistic多因素回归分析示合并多发损伤、创伤性/失血性休克、颈椎损伤及胸部损伤为影响重型颅脑损伤患者近期预后的独立危险因素。结论合并多发损伤、创伤性/失血性休克、颈椎损伤及胸部损伤是影响重型颅脑损伤患者近期预后的独立危险因素。

长链非编码RNA调控细胞凋亡及自噬的研究进展

细胞死亡根据其表观形态学特征分为：凋亡、自噬、坏死等,随着研究的进展,逐步发现了其它多种死亡类型。细胞死亡是胚胎发育、组织稳态和免疫调节的基础。机体通过多种不同的细胞死亡方式维持各种组织、器官的正常运行以及机体内环境的稳态。细胞死亡机制的失调可引起肿瘤等多种疾病。

应用微流路芯片高压凝胶电泳检测精子RNA

目的检测精子的RNA,以保证后续实验有可靠、准确的结果。方法收集成年男性活力正常的精子,提取其RNA,应用微流路芯片高压凝胶电泳检测精子总RNA,以健康成人淋巴细胞总RNA作对照。结果检测发现在人类精子中有大量的基因表达。精子RNA的电泳图出现两个峰,两峰的位置都较正常体细胞提前,先出的峰其形相对尖锐,后出的峰其形较宽,跨越5S,但仍呈典型的倒U形分布,两峰的比值,远远大于2∶1,在其他位置无明显吸收峰。结论应用微流路芯片高压凝胶电泳,可进行精子RNA简单、直观地检测和质量控制。

从石榴皮中提取鞣质的工艺条件及含量测定研究

目的采用适当的方法提取石榴皮中鞣质并测其含量。方法用水煎煮法、超声波法提取;用络合滴定法测定含量。结果石榴皮中鞣质含量为15～40%,超声波提取法要比水煎煮法操作程序简便,自动化程度高,超声波提取最佳工艺条件为,提取时间20～30min,超声频率为45kHz。

梯度热打击对大鼠肝库普弗细胞吞噬功能的影响

目的研究梯度热打击对体外培养大鼠肝库普弗细胞吞噬功能及分泌功能的影响。方法设置培养库普弗细胞的热打击温度梯度(37、39、41、43℃),使用PI及Hochest33342染色细胞检测热打击后细胞受损情况,采用CCK-8法检测细胞增殖率,流式细胞术检测库普弗细胞对溶菌酶吞噬能力的改变。结果与正常对照组相比,热打击各组均出现不同程度的细胞损伤,且随热打击程度加深而加重(P<0.05)。细胞增殖实验显示,与正常对照组相比,热打击后6h,41℃和43℃组增殖率明显下降(P<0.01),12h时仅43℃组增殖率明显下降(P<0.001),至24h,各热打击组与正常对照组差异无统计学意义。流式细胞术显示,1h热打击结束后,与正常对照组相比,各热打击组细胞均呈现吞噬功能的下降,以43℃组最为明显(P<0.05)。结论热打击可导致大鼠肝库普弗细胞吞噬功能受到抑制,可能与热打击对细胞的直接细胞毒作用有关。热打击对于肝库普弗细胞影响的进一步研究将有助于了解热射病的发病机制。

用于HIV诊断的Oligo基因芯片研制

目的研制快速筛查诊断HIV病毒的Oligo芯片。方法以HIV-1B亚型U26942全基因组序列为靶序列,利用DNA Club、Oligo 6.0、BLAST、Alignment等生物信息学软件,设计高度特异、长度均一、具近似熔解温度(Tm)的Oligo 探针,并制备成Oligo芯片。B(U26942)、C(U46016)、F(AF075703)、G(AF061640)四种亚型质粒分别经RD-梯度PCR与随机特异性引物PCR,经荧光标记后与芯片杂交,扫描芯片后进行统计学分析。结果与结论获得22条60 mer 探针,Oligo芯片特异性、敏感性及稳定性好,为进一步应用提供了条件。

两种标记方法对60mer寡核苷酸芯片背景信号影响的初步分析

研究两种不同的样本标记方法对人全基因组高密度60mer寡核苷酸芯片背景信号的影响。收集5对患病与健康人外周血单个核细胞,分别提取总RNA后,采用限制性显示技术(restrictiondisplay,RD)进行样本双色(Cy3/Cy5)荧光标记,与5张Agilent60mer高密度(22K)Human1B寡核苷酸芯片进行杂交。芯片全部杂交点分3组基因探针组、阳性对照组和阴性对照组。阳性对照采用荧光标记寡核苷酸直接掺入法进行标记。对全部杂交信号点的Cy3和Cy5背景信号值,用SPSS软件进行数据转换、正态性检验、方差齐性检验、变异系数分析和重复数据的方差分析。数据分析结果显示,Cy3标记的背景信号值均高于Cy5标记的背景信号值。重复测量数据的方差分析表明,在Cy3和Cy5标记中,两种不同标记方法间的背景信号值的差异极显著(PCy3<0.01,PCy5<0.01),且RD标记点的背景信号平均值低于荧光标记寡核苷酸直接掺入标记法标记的阳性对照点。RD标记方法是一种有用的低背景信号的高密度长链寡核苷酸芯片样本标记方法。

异丙酚配伍米索前列醇用于人流镇痛420例临床分析

目的评价异丙酚用于人流镇痛的安全性,观察阴道放置米索前列醇的宫颈松弛作用。方法将要求人流镇痛的早孕健康妇女随机分为两组。A组:术前4h阴道后穹隆放置米索前列醇200μg,然后异丙酚静脉麻醉下进行人工流产手术。B组:术前无处理,直接异丙酚静脉麻醉下实施人工流产手术。两组进行多项指标对比分析。结果两组手术的麻醉效果,出血量均无显著差异(P<0·05)。但A组宫颈松弛度明显好于B组,手术时间也较B组明显缩短,两组比较有显著性差异(P<0·05);两组均无人流综合征发生,但A组和B组分别有2例的3例呼吸抑制发生。结论异丙酚用于人流镇痛,起效快,效果好,但要警惕呼吸抑制的发生,提高其安全性。术前4h阴道后穹隆放置米索前列醇200μg有较好的宫颈松弛作用。

一种用于微阵列分析的通用引物U_2联合标记方法(英文)

目的报告一种新的用于微阵列研究的荧光标记技术:通用引物U2联合标记技术(UPL);比较UPL与随机引物等其他标记方法的效率和可重复性。方法分别用4种标记方法标记流感病毒RNA样品,与流感病毒寡核苷酸检测芯片杂交后,用Spss10.0软件对杂交结果进行分析。结果UPL方法在标记物杂交的荧光强度、信噪比、探针真阳性率和可重复性等方面均高于随机引物逆转录掺入标记法,而与其他两种RD标记方法相当,但标记过程相对更加简单。结论UPL方法是一种新颖而有效的标记方法,在微阵列技术研究方面具有广泛的应用价值。