自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤可提高小鼠同种异体坐骨神经移植效率

背景:近年最新研究表明,华勒氏变性的发生与许旺细胞的自噬活动密切相关,对许旺细胞自噬活动进行调控,可以显著影响华勒氏变性的发生发展,从而改变后续的轴突再生及髓鞘化过程。目的:在同种异体神经移植中对移植片段的细胞自噬过程进行抑制,观察是否影响移植后的修复效率。方法:获取8只雌性C57BL/6J小鼠(购自北京维通利华)坐骨神经片段16条,分2组,分别于含自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤的培养基及普通培养基中处理72 h。取16只雌性C57BL/6J小鼠,建立左侧坐骨神经缺损模型,实验组(n=8)植入含自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤培养基处理过的坐骨神经片段,对照组(n=8)植入普通培养基处理的坐骨神经片段,术后2,4,6,8周,记录坐骨神经指数;术后8周取再生坐骨神经段,分别进行苏木精-伊红染色、免疫荧光染色、甲苯胺蓝染色、透射电镜观察等。动物实验通过北京协和医学院动物伦理委员会批准。结果与结论:①实验组术后8周的坐骨神经指数高于对照组(P<0.05),其余时间点两组间比较差异无显著性意义(P>0.05);②苏木精-伊红染色显示,实验组神经组织完整,对照组神经组织可见大面积空洞;③免疫荧光染色显示,实验组可见较完整的神经束结构,对照组未见完整的神经束结构;④甲苯胺蓝染色显示,实验组可见有髓神经纤维和部分再生无髓神经纤维,对照组仅见少量有髓神经纤维与新生无髓轴突;⑤透射电镜显示,实验组髓鞘厚度及有髓纤维直径均大于对照组(P<0.05);⑥结果表明应用3-甲基腺嘌呤处理移植前神经片段,可抑制许旺细胞自噬,有助于保留移植物髓鞘结构完整性,促进轴突再生及功能的恢复。

西罗莫司治疗卡波西形血管内皮瘤的研究进展

卡波西形血管内皮瘤(Kaposiform hemangioendothelioma,KHE)是一种罕见的婴幼儿血管内皮瘤,大部分患儿病情进展迅速且无自发缓解趋势,其临床表现复杂多样,可伴随多种严重血液系统异常即Kasabach-Merritt现象(KMP),严重影响患儿的生活质量甚至危及生命。目前的治疗方法主要有皮质醇激素、长春新碱化疗、干扰素、单抗、西罗莫司、普萘洛尔等,西罗莫斯作为近年兴起的治疗药物,可从多方面缓解KHE的临床症状,改善患儿病情及生活质量,对于复杂性KHE的治疗有广泛的临床应用前景。本文对比既往治疗方法与西罗莫司治疗KHE的特点,并探讨应用西罗莫司治疗KHE的机制研究与应用现况。

小鼠肌源性干细胞悬浮培养的可行性

目的探讨悬浮培养获取小鼠肌源性干细胞(MDSC)的可行性。方法分离2周龄C57BL/6小鼠肌肉组织,采用悬浮培养法培养MDSC。分别于培养前(pp0)、培养2 h(pp1)及之后每24 h(共5次,分别标记为pp2、pp3、pp4、pp5和pp6)显微镜下观察悬浮细胞形态并计数。收集pp2~pp6时段含悬浮细胞的培养上清液,流式细胞仪检测CD34、抗干细胞抗原1(Sca-1)表达并计算其阳性细胞所占比例。取pp6时段MDSC,采用施万细胞诱导7天,观察细胞形态变化,免疫荧光检测细胞p75 NGF表达;另取pp6时段MDSC,进行成骨细胞诱导,观察细胞形态变化,并行茜素红染色。结果镜下观察显示,随培养时间延长,悬浮细胞数量逐渐增多,细胞呈小球形,单个或成团,表面光滑,折光率高。pp2、pp3、pp4、pp5和pp6时段悬浮细胞数量分别为(2. 64±0. 20)×105、(3. 08±0. 19)×105、(3. 63±0. 13)×105、(4. 64±0. 15)×105、(6. 06±0. 26)×105个,各时段悬浮细胞数量两两比较P均<0. 05。CD34+、Sca-1+、CD34++Sca-1+细胞所占比例随培养时间延长均逐渐增加(P均<0. 05)。施万细胞诱导培养7天,光镜下可见小球形、高折光率细胞逐渐分化为长条形、串珠样类施万细胞,部分细胞死亡,部分仍保持小球形;免疫荧光显示,约90%诱导细胞p75 NGF受体反应阳性。成骨诱导培养21天,光镜下可见小球形折光率高的细胞大量分化为长条形细胞,部分显示片状,有晶体形成。茜素红染色大部分红染,并可见棕褐色结晶状矿化结节形成。结论悬浮培养法可获取初始细胞量约3倍的小鼠MDSC,且培养获得细胞具有良好的成神经、成骨分化能力。

悬浮集簇培养与悬浮分散培养对肌源性干细胞增殖的影响

目的在悬浮培养肌源性干细胞(MDSC)的基础上初步探讨集簇与分散培养对MDSC增殖活性的影响。方法采取2周龄C57BL/6小鼠四肢骨骼肌,用机械法与多步酶消化法制备细胞悬液进行悬浮培养,在培养过程中分别吹打(分散培养组)与静置(集簇培养组)。光镜观察与细胞计数统计增殖数量。流式细胞检测与分化实验验证细胞干性。结果集簇培养组MDSC呈团簇状,细胞表面光滑,呈小球形,折光率高;分散培养组细胞呈单个或小团簇状,细胞表面光滑,小球形,高折光,偶见细胞皱缩。细胞计数结果显示悬浮集簇培养pp2细胞数量(4.0±0.5)×10~5个,悬浮分散培养pp2细胞数量(4.2±0.7)×10~5个,悬浮集簇培养pp6细胞数量(14.9±0.7)×10~5个,悬浮分散培养pp6细胞数量(10.5±1.3)×10~5个,分别增加至约3.7倍和2.5倍,悬浮集簇培养增殖量约是分散培养组的1.7倍,差异有统计学意义(P<0.05)。流式细胞检测发现集簇培养表面干性标记物表达量更高。结论悬浮集簇培养较分散培养获得细胞量更多,细胞干性更好。

细胞自噬在周围神经损伤及再生中研究进展

目的总结细胞自噬在周围神经损伤后病理生理变化过程中的作用及调控机制,为周围神经损伤的治疗提供新的思路。方法广泛查阅近5年与细胞自噬在周围神经损伤及再生方面的相关文献,并进行总结与讨论。结果通过对小鼠进行药物干预及基因敲除等方法调节其自噬功能后证实,雪旺细胞自噬主要通过JNK/c-Jun通路影响后续的髓鞘崩解、炎性细胞浸润及轴突再生等一系列过程,通过调节雪旺细胞自噬可以改变周围神经损伤后瓦勒变性的发生、发展,维持周围神经结构的完整性,但其对后续轴突再生的作用仍存在争议。结论细胞自噬过程在周围神经损伤后病理生理变化过程中起着重要的调节作用,深化研究其机制及作用,可为周围神经损伤后治疗方法的研究提供新思路。

肌外膜导管中细胞对周围神经再生影响的实验研究

目的探讨小鼠腹外斜肌外膜制备的肌外膜导管(epimysium conduit,EMC)中的细胞成分对坐骨神经再生影响。方法取8周龄雄性C57BL/6J增强绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)小鼠的腹外斜肌外膜,修剪成5 mm×3 mm,制备成管状(即EMC)。取部分肌外膜采用不同照射剂量(0、15、20、25、30、35 Gy)进行细胞迁移抑制处理,并计数迁移细胞,选择迁移细胞数最少的肌外膜制备EMC;另取部分肌外膜行脱细胞处理,常规HE和Masson染色鉴定脱细胞效果后制备EMC。取24只C57BL/6J野生型小鼠制备右后肢3 mm长坐骨神经缺损模型后,随机分为3组(n=8),分别采用EMC(A组)、经细胞迁移抑制处理后的EMC(B组)、脱细胞处理后的EMC(C组)修复缺损。术后16周取再生神经中段行大体、甲苯胺蓝染色、免疫荧光染色以及透射电镜观察。结果肌外膜细胞迁移抑制观察示,15 d时随照射剂量增大,细胞迁移数逐渐减少;除30 Gy组与35 Gy组间比较差异无统计学意义(P>0.05)外,其余各组间比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。选用经35 Gy照射剂量处理后的肌外膜进行体内实验。肌外膜脱细胞处理后均未见细胞核,且可缝合成导管状,制备EMC。术后16周各组EMC中神经均再通,A组修复后的坐骨神经最粗,B组次之,C组最细;免疫荧光染色可见A组EMC中EGFP细胞包绕再生轴突;甲苯胺蓝及透射电镜观察,A组再生神经轴突数及再生有髓神经鞘厚度显著优于B、C组(P<0.05),B、C组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论 EMC中的细胞成分参与并促进了小鼠坐骨神经的再生。