猪圆环病毒1型、2型、3型SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR鉴别方法的建立及应用

猪圆环病毒(PCV)包括猪圆环病毒1型(PCV1)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪圆环病毒3型(PCV3)。近些年来,PCV1、PCV2、PCV3基因型之间存在共感染,因此建立一种快捷、特异、敏感的PCV1、PCV2、PCV3的SYBR GreenΙ实时荧光定量PCR鉴别检测方法显得尤为必要。本试验通过特异性引物筛选,各项反应条件优化,建立了实时荧光定量PCR鉴别方法。结果表明:PCV1、PCV2、PCV3检测下限分别为40.3、25.2、22.4 copies/μL。与猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)均无交叉反应。批内及批间变异系数均小于1%。对98份PCV疑似阳性病料检测结果表明,PCV1、PCV2、PCV3感染率分别为10.2%、65.3%、53.1%,共感染率为7.1%。该方法具有良好的特异性、敏感性和稳定性,为PCV1、PCV2、PCV3的早期检测、定量检测及后期研究提供了技术手段。

副猪嗜血杆菌荧光定量PCR检测技术的建立与应用

根据GenBank中的副猪嗜血杆菌(HPS)的infB基因的序列(DQ781808.1),利用分子生物学软件Premier 5.0设计一对特异性引物,建立基于SYBR Green I荧光定量PCR检测HPS的技术。试验采用煮沸法从HPS培养物中提取DNA,进行PCR扩增。将鉴定正确的目的基因片段克隆入pMD18-T载体中,转化大肠杆菌DH5α,经PCR及测序鉴定后得到阳性重组质粒,作为阳性标准品。结果表明,该方法对HPS具有良好的特异性,不与其它猪源细菌发生交叉反应,其敏感性比常规PCR高100倍,而且非常稳定,批间与批内重复试验变异系数均小于2.5%。临床应用表明本方法的建立实现了对HPS的快速诊断和定量的检测。

不同猪瘟免疫程序对仔猪母源抗体水平的影响

本研究采用猪瘟病毒ELISA抗体检测试剂盒，对应用不同猪瘟免疫程序的猪场进行仔猪母源抗体水平检测。结果显示，在20日龄以内仔猪母源抗体的OD630平均值和阳性率均维持较高的水平，仔猪能够获得较好的母源抗体保护，避免猪瘟病毒的早期感染。随着日龄增长，仔猪母源抗体逐渐下降，尤其在断奶后一周（30-40日龄）下降趋势最为显著。本研究可为本地区规模化猪场猪瘟免疫程序的制定尤其是仔猪首免日龄的确定提供参考依据。

山东省规模化猪场四种病毒性疾病的抗体检测

为及时了解山东省规模化猪场重大病毒性疾病的抗体水平,试验采用进口ELISA试剂盒,分别对山东省不同地区7个规模化猪场分别送检的共224份血清进行猪瘟病毒、猪蓝耳病病毒、猪伪狂犬病毒及猪圆环病毒的抗体检测。结果显示：7个规模化猪场猪瘟、猪蓝耳病、猪圆环病毒病的抗体阳性率分别在20.00%~87.50%、5.00%~93.10%、38.89%~100.00%之间;猪伪狂犬病野毒感染率为0.00%~88.89%,经SPSS 19.0软件分析知7个不同猪场之间各种疾病的抗体阳性率均存在显著差异性（P〈0.05）。根据以上数据对猪场四种病毒性疾病的抗体水平进行分析,为制定完善的免疫防控方案提供重要的依据。

HeLa细胞Ⅰ型干扰素效应因子实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立及初步应用

本试验旨在建立一种用SYBR GreenⅠ荧光染料检测HeLa细胞Ⅰ型干扰素效应因子ISG15、ISG56、Mx1、OAS和PKR mRNA表达水平的实时荧光定量RT-PCR检测方法,并在口蹄疫病毒(FMDV)L蛋白抑制Ⅰ型IFN发挥效应的信号通路中进行初步应用。利用TRIzol法提取总RNA,经Oligo d(T)15进行反转录,利用PCR扩增各段目的基因,并克隆至pMD18-T载体,转化大肠杆菌DH5α,经鉴定为阳性的重组质粒作为标准品模板建立SYBR GreenⅠ荧光定量RT-PCR标准曲线和熔解曲线,并进行灵敏性、特异性和重复性试验。根据建立的实时荧光定量RT-PCR方法,检测FMDV L蛋白对Ⅰ型IFN效应因子的抑制效果。HeLa细胞在转染FMDV L蛋白真核表达质粒,并受到Ⅰ型IFN刺激后ISG15、ISG56、Mx1、OAS和PKR的相对表达量较转染空载体或表达GST的真核表达质粒明显降低。本试验建立了HeLa细胞Ⅰ型IFN效应因子的实时荧光定量RT-PCR检测方法,为在mRNA水平上对HeLa细胞Ⅰ型IFN效应因子的定量分析奠定了基础,并成功地初步应用于FMDV L蛋白抑制Ⅰ型IFN发挥效应的信号通路的研究中。

猪流行性腹泻病毒LAMP检测方法的建立及初步应用

猪流行性腹泻病毒是引起仔猪腹泻死亡的主要病原。为实现对猪流行性腹泻病毒(PEDV)的快速检测,利用PEDV S基因设计特异性引物,通过优化各种反应条件,建立了检测PEDV的环介导等温扩增快速检测方法(LAMP)。此方法特异性好,敏感度强,将反转录后的病毒c DNA稀释到108倍仍可检出,是PCR方法的100倍。本研究建立的LAMP方法操作简便、灵敏度高、特异性强,为临床PEDV的快速检测和预防奠定基础。

谷朊粉的功能特性及改性研究

通过一定方法改性之后的谷朊粉,在食品等工业化生产中有着广泛的应用。本文论述了谷朊粉的化学组成和功能特性,以及近年来对谷朊粉改性的研究进展。

山东省猪群TTV感染情况及分子流行病学分析

为了确定Torque teno virus(TTV)在山东省猪群中是否存在及其感染情况,本研究利用套式PCR方法检测了来自山东省不同地区10个猪场的230份血液样品和组织样品。结果表明猪群中TTV1和TTV2感染总阳性率分别为45.2%和85.7%。两者的混合感染率为39.3%。用套式PCR引物扩增出TTV1和TTV2的部分片段,并将扩增出的部分基因与已报道的TTV1和TTV2病毒序列进行比较分析。分析结果显示TTV可分为TTV1和TTV2两大分支,其TTV1和TTV2与参考株相比同源性分别为88.0%～92.8%和91.9%～94.1%。本研究证实在山东省猪群中存在TTV感染,由于TTV可以感染人,其在公共卫生学方面的意义应当引起我们的重视。

两株高致病性PRRSV ORF6和ORF7基因克隆及序列分析

应用RT—PCR方法从实验室分离的两株高致病性PRRSV SX、ZQ株中扩增出ORF6和ORF7，将其分别克隆、测序。用DNAStar软件分析所测序列，并与VR-2332株、LV株、周边国家及国内分离株进行核苷酸和推导氨基酸同源性比较，并绘制系统进化树，结果ORF6、ORF7核苷酸与北美洲型的同源性为91．1％～100％，与欧洲型的同源性为66．2％～70．7％，推导氨基酸与北美洲型的同源性为91．2％～100％，与欧洲型的同源性为62．3％～82．3％。证明新分离到的PRRSVSX株、ZQ株仍属北美洲型。SX株ORF6、ORF7核苷酸与国内新分离到的高致病性PRRSV JXA1株同源性分别为99．8％、100％；ZQ株ORF6、ORF7核苷酸与国内新分离到的高致病性PRRSV JXA1株同源性分别为99．6％、99．7％。

审美观照下的比较与辨析——关于大学语文课中的外国文学作品教学

本文介绍了大学语文课中外国文学作品的教学经验与体会。主要以大学语文教材选入的中国文学作品为参照系 ,从人物塑造、艺术结构和题材内容三个方面进行审美观照下的比较与辨析 。

圆环病毒2型抗体胶体金检测试纸条的初步研制及应用

为快速检测猪群中猪圆环病毒2型抗体,采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒,并标记纯化的猪圆环病毒Cap蛋白和兔IgG,包被至玻璃纤维膜上制备金标垫,将纯化抗原和羊抗兔IgG分别包被至硝酸纤维素膜的检测线与质控线上,建立了检测猪圆环病毒2型抗体的胶体金免疫层析方法并组装检测卡。结果显示,组装的检测卡只与圆环病毒阳性血清发生特异性反应,阳性血清稀释10倍后仍然能够检出。用此检测卡与商品化ELISA试剂盒对100份临床血清进行平行检测,阳性率分别为89%和93%,两种方法符合率在95%以上。该方法操作简便、特异性强,可广泛应用于基层,也为圆环病毒疫苗效果评价提供了良好的试剂选择。

肉鸽新城疫病毒山东分离株的分离鉴定及其F基因的分子特性分析

从山东某发病肉鸽的体内分离到一株新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV),命名为Pigeon-Shandong-JN-08(简写JN08),对其融合蛋白(fusion,F)进行序列和分子特性的分析,以了解肉鸽NDV的遗传起源和分子特性。JN08经病毒蚀斑克隆纯化后动物回归试验可产生典型的NDV病变。研究结果发现,F蛋白多肽裂解位点的序列为112RRQKRF117,符合鸽源NDV强毒氨基酸基序。F基因分型及同源性比较显示:JN08与绝大多数鸽源毒株同属于基因Ⅵ型;其F基因与基因Ⅱ型毒株LaSota,B1,Bingham,TEX-48氨基酸同源性为89.9%,89.7%,90.4%,89.7%,与基因Ⅰ型毒株Ulster67的氨基酸同源性为91.3%,与基因Ⅲ型传统强毒F48E9的氨基酸同源性为92.8%;与国内鸽分离株P1-03,CH98-98,JS1-06,PB01-96和GZ-07的氨基酸同源性分别为91.3%,94.6%,94.8%,95.1%,94.0%;与国外鸽分离株Capital3-97,Tigre6-99,1166-02,IT227-97,2736-00,NY-84,TX3503-04,248VB-98的同源性分别为96.2%,93.8%,98.0%,96.8%,97.1%,96.8%,96.8%,98.4%。从F基因遗传进化树上发现:JN08与国外分离株的遗传距离较近,处于同一基因亚型上,而与国内分离株的遗传距离较远。

SPA胶体金免疫层析方法检测PCV2抗体的初步建立及应用

采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒,并将其标记SPA,将金标SPA包被至玻璃纤维膜上制备金标垫,将纯化的Cap蛋白、兔抗SPA抗体分别包被至硝酸纤维素膜的检测线与质控线上,建立了一种检测猪圆环病毒2型抗体的胶体金免疫层析方法。检测结果显示,组装的检测卡只与圆环病毒阳性血清发生特异性反应,检测的灵敏度可以稀释到100倍。用此检测卡与商品化ELISA试剂盒对86份临床血清进行平行检测,两者的检测阳性率分别为65.12%和70.93%。该方法检测速度快,15min内可出结果,特异性强,操作简便,可广泛应用于基层。

PCV2 Rep蛋白N-糖基化位点突变对病毒复制的影响

N-糖基化对病毒的感染与增殖均具有重要作用,与PCV2复制相关的Rep蛋白含有三个N-糖基化位点。为了分析PCV2Rep蛋白N-糖基化位点突变对病毒复制的影响,本试验构建了三个双拷贝突变体感染性克隆2M23、2M256、2M286,并成功拯救病毒。通过间接免疫荧光检测病毒的拯救效果,TCID50测定病毒的感染力,荧光定量PCR检测细胞病毒的载量。结果显示,PCV2Rep蛋白的23~25aa、256~258aa N-糖基化位点突变后降低病毒的复制能力,而286~288aa突变后增强病毒的复制能力,为进一步阐明PCV2的复制及致病机制提供参考。

山东PRRSV流行株ORF5、ORF6、ORF7基因序列的分子特征

采用RT-PCR技术对2001-2007年分离自山东地区10株（ShanDong-3、SD-JN、SD-ZQ、SD1、SD2、SD3、SD4、SD5、SD6和SD7）猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）进行ORF5、ORF6和ORF7基因的扩增、克隆和测序,与已知序列的毒株的相应片段进行同源性分析比较,并对其分子特征进行分析。结果表明：该10株病毒仍属北美洲型,其中2001-2002年分离的SD1株、SD2株和2006年分离的SD6株核苷酸序列之间的ORF5、ORF6、ORF7同源性分别为99.2%,99.8%,100%,均与北美洲原型代表株（VR-2332株）和疫苗毒MLVRe-spPRRS Repro USA遗传距离较近,同属一大分支;2006-2007年分离的PRRSV ShanDong-3、SD-JN、SD-ZQ、SD3,SD4,SD5,SD7分离株ORF5、ORF6、ORF7同源性分别为97.8%-100%,99.4%-99.8%,99.2%-99.7%,均与国内96年Ch-1a和2002年HB-1株及2006年分离鉴定的国内高致病性分离株（JXA1、Shanghai、HEB1）同属一个大的分支。首次证实目前山东省同时存在高致病性PRRSV和传统PRRSV,并且有由传统PRRSV向高致病性PRRSV演化的趋势。

多重PCR诊断猪细小病毒、伪狂犬病毒和圆环病毒Ⅱ型方法的建立和应用

根据GenBank中已发表的猪细小病毒(PPV)、猪伪狂犬病毒(PRV)和猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2)等3种病毒基因序列,对各病毒基因区进行同源性分析,确定PPV VP2、PRVgB、PCV2ORF1基因的保守区为各病毒的诊断靶序列。在建立各病毒单重PCR技术的基础上,优化多重PCR反应条件,建立了三种病毒的多重PCR技术。用78份临床病料对本研究多重PCR技术和单重PCR技术进行对比验证,结果显示,总符合率为97.4%以上。该方法特异性强、敏感性高,为PPV、PRV和PCV2临床诊断和流行病学调查等研究提供了新手段。

盐酸克伦特罗单克隆抗体的制备和鉴定

为进一步建立克伦特罗(CL)残留检测方法,给制备CL残留检测试剂盒打下基础,进行了CL单克隆抗体(McAb)的制备研究。以重氮反应,将CL与牛血清白蛋白(BSA)、鸡卵清白蛋白(OVA)偶联,分别制备免疫原和检测原,并通过杂交瘤技术,获得了5株能稳定分泌特异结合CL小分子的单克隆抗体杂交瘤细胞株(1E9A9、2A9C1、3F2E9、6G2E9、6E10D9)。这5株细胞株经过体外传代培养和冻存复苏后均能稳定分泌抗体。用间接酶联免疫吸附试验(ELISA)测定的这5株细胞上清液抗体效价分别为1:1.28×10~5、1:5.12×10~5、1:1.28×10~5、1:5.12×10~5、1:2.56×10~5;选用3F2E9、6E10D9细胞株,制备CL单克隆抗体腹水并纯化,其纯化后的腹水抗体效价分别为1:1.28×10~5、1:2.56×10~5,BCA(2,2-联喹啉-4,4-二甲酸二钠)方法检测的浓度分别为1.60 mg/mL、1.54 mg/mL;最终通过斑点ELISA(Dot-ELISA)方法测定CL抗原与这2株抗体有较强的结合力。在上述方法的制备及验证下,成功获得了特异性较高的CL单克隆抗体,为进一步研制CL残留检测试剂盒奠定了基础。

新型农业生产经营组织发展与科技支撑研究

文章分析了山东省新型农业生产经营组织的发展现状,阐述了农业科技在新型农业生产经营组织发展中的作用,剖析了科技支撑新型农业生产经营组织发展中存在的问题,并针对问题提出了加强顶层设计、制定实施农业技术补贴政策、制定实施多元化的农业科技投资政策等对策,以促进新型农业生产经营组织发展。