蝎毒多肽对人骨肉瘤细胞株MG-63活性的影响

目的探讨蝎毒多肽对人骨肉瘤MG-63细胞增殖凋亡的影响。方法利用0、4、8、12μg/mL浓度蝎毒多肽处理MG-63细胞12、24、48 h,CCK-8法检测细胞活性、镜下观察细胞形态变化、吖啶橙荧光染色法观察细胞凋亡,8μg/mL蝎毒多肽处理MG-63细胞24、48 h,Hoechst-33258荧光染色观察细胞核染色质形态。结果 4、8、12μg/mL的蝎毒多肽可抑制MG-63细胞活性,抑制其增殖,呈剂量-时间依赖性。8μg/mL处理24 h细胞存活率为0.5506±0.0502,与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.01)。吖啶橙荧光染色,细胞染色质浓缩,细胞核碎裂成点状,被染成大小不一、致密浓染的绿色颗粒,随着浓度增大、时间延长,坏死细胞逐渐增多。呈现凋亡核碎裂典型变化,随剂量增加更趋明显。呈剂量依赖性抑制其增殖能力。Hoechst-33258染色观察可见凋亡细胞染色质呈固缩或碎裂状染色质,染色质着色不均,核形态各异。随作用时间增加而更趋明显。结论蝎毒多肽可以抑制骨肉瘤细胞活性,抑制其体外增殖,诱导其发生凋亡,该作用呈剂量依赖和时间依赖。

吴茱萸碱通过阻滞细胞周期而抑制人骨肉瘤细胞增殖

目的体外细胞实验检测吴茱萸碱对骨肉瘤HOS细胞株细胞周期及体外增殖能力的影响。方法通过利用浓度为0、3、6、12μmol/L吴茱萸碱处理骨肉瘤HOS细胞48 h后,Hoechst-33258荧光染色观察不同浓度吴茱萸碱处理后HOS细胞核的形态学变化。利用流式细胞术检测3μmol/L的吴茱萸碱处理后骨肉瘤HOS细胞的细胞周期分布变化。结果3、6、12μmol/L的骨肉瘤吴茱萸碱处理细胞,细胞呈现凋亡核碎裂等典型变化,而且随药物剂量增加而更趋明显。呈剂量依赖性抑制其体外增殖能力。3μmol/L吴茱萸碱处理骨肉瘤HOS细胞0、24、48、72 h,各组细胞周期变化如下:G0/G1期:对照组(51.12±2.13)%、24 h(19.17±1.02)%、48 h(16.94±1.67)%、72 h(11.05±1.25)%;S期:对照组(32.92±0.73)%、24 h(31.00±1.42)%、48 h(32.38±3.03)%、72 h(29.18±2.87)%;G2/M期:对照组(16.01±2.26)%、24 h(49.82±0.62)%、48 h(50.6767±2.80)%、72 h(59.56±1.97)%。结论吴茱萸碱可诱导人骨肉瘤HOS细胞发生G2/M期阻滞,而S期变化不明显。说明吴茱萸碱可以抑制骨肉瘤细胞的增殖能力,并阻滞细胞周期于G2/M期。

钌(Ⅱ)配合物[Ru(dmp)_(2)(NMIP)](ClO_(4))_(2)抗骨肉瘤HOS细胞的凋亡

目的探讨钌(Ⅱ)配合物[Ru(dmp)2(NMIP)](ClO4)2对人骨肉瘤HOS细胞的凋亡作用初步作用机制。方法采用荧光定量PCR检测钌(II)配合物作用于人骨肉瘤HOS细胞后RNA变化,蛋白免疫电泳法检测钌(II)配合物作用于人骨肉瘤HOS细胞后细胞凋亡蛋白变化。结果钌配合物作用于HOS细胞24 h后,提取总基因逆转录后做荧光定量PCR。相比对照组,25、50、100μmol/L钌配合物组Bcl2的mRNA表达明显降低(分别为0.86±0.02、0.52±0.01、0.4±0.01)(P<0.05),而Bax的mRNA表达明显升高(分别为1.18±0.18、1.7±0.10、1.69±0.10),Caspase3的mRNA表达明显升高(分别为1.22±0.11、1.61±0.12、1.62±0.06)。0、25、50、100μmol/L钌配合物能降低细胞体内Bcl2蛋白表达(分别为0.52±0.03、0.55±0.08、0.39±0.02、0.14±0.01),增加Bax蛋白表达(分别为0.52±0.01、0.60±0.02、0.64±0.03、0.62±0.02),增加Caspase3蛋白表达(分别为0.57±0.01、0.61±0.01、0.68±0.01、0.64±0.01)(P<0.05)。结论钌配合物通过线粒体引起的内源性凋亡通路引起骨肉瘤细胞凋亡。

腰椎后路减压内固定融合术治疗退行性腰椎管狭窄症177例疗效分析

目的评价腰椎后路减压内固定融合术(PLIF)治疗退行性腰椎管狭窄症(DLSS)的临床效果,并分析腰椎内固定融合术对邻近节段退变的可能影响因素。方法对行PLIF的177例DLSS患者的随访资料进行回顾性分析,随访时间24～103个月。采用JOA下腰痛治疗评价标准、ODI功能障碍指数、VAS评价表、Henderson疗效标准观察手术疗效,并通过UCLA及Pearce分级标准分析术后邻近节段退变(ASD)的危险因素。结果 (1)177例患者术前JOA评分(4.1±1.127)分,术后(12.7±1.495)分,术后平均改善指数为(8.6±0.2)分,平均改善率为(79±1)%;术前ODI指数(54.86±15.87)%,术后(19.36±8.98)%,术后平均改善指数为(35.50±1)%,平均改善率为(64.71±1)%;术前VAS评分(6.4±0.2)分,术后(2.1±0.2)分,术后平均改善指数为(5.15±0.2)分;Henderson疗效标准:177例患者中优148例(83.61%),良21例(11.86%),可5例(2.82%),差4例(2.26%),优良率达95.47%。术后较术前明显改善,差异有统计学意义(P<0.05)。(2)术后邻近节段退变ASD的发生与患者年龄、性别无显著相关,与术前是否存在邻近椎间盘退变显著相关,且融合节段越多,其术后ASD退变程度越高。结论 PLIF是治疗DLSS的有效方法,术后ASD的发生与患者年龄、性别无显著关系,与术前邻近椎间盘是否存在退变呈显著相关,即术前邻近椎间盘退变是ASD的可能危险因素。

吴茱萸碱抑制人骨肉瘤HOS细胞的增殖并促进其凋亡

目的探讨吴茱萸碱对骨肉瘤HOS细胞株增殖凋亡的影响及其可能的机制。方法通过利用0、1、2、4、8μmol/L浓度吴茱萸碱处理HOS细胞24、48 h后,利用CCK-8法检测HOS细胞活性。用3μmol/L的吴茱萸碱处理HOS细0、24、48 h后,利用细胞凋亡-Hoechst染色试剂盒染色观察HOS细胞细胞核染色质的形态。用3μmol/L吴茱萸碱处理0、24、48 h后,利用流式细胞仪检测HOS细胞的凋亡率。3μmol/L吴茱萸碱处理0、24、48 h后,Westernblot检测HOS细胞内Caspase 3、Bcl-2蛋白的表达变化情况。结果 2~8μmol/L的吴茱萸碱可抑制HOS细胞的细胞活性,抑制其增殖,呈剂量-时间依赖性。8μmol/L处理48 h后细胞存活率为0.453±0.071,与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.01)。Hoechst-33258染色观察可见凋亡细胞染色质颜色发白,呈固缩状或者碎裂状染色质,染色质着色不均匀,核形态各异。流式细胞仪检测3μmol/L吴茱萸碱处理HOS细胞0、24、48 h后的凋亡率分别为(5.32±1.62)%、(10.85±1.49)%和(12.47±0.59)%,与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.01)。吴茱萸碱可上调HOS细胞内的Caspase 3蛋白的表达,同时下调Bcl-2蛋白的表达,与对照组相比较,差异有统计学意义(P<0.05)。结论吴茱萸碱可降低人骨肉瘤HOS细胞的细胞活性,抑制其体外增殖,诱导其发生凋亡,其机制可能与其上调Caspase 3蛋白的表达,下调Bcl-2蛋白的表达有关。

BMS-345541对人骨肉瘤细胞MG63凋亡及其作用机制

目的研究BMS-345541对人骨肉瘤细胞MG63凋亡的影响及其可能的机制。方法以0、2、4、6、8、10μmol/L BMS-345541处理MG63细胞24、48 h后,用CCK-8法检测细胞存活率。用0、2、4、8μmol/L药物作用细胞24 h后,以PI染色法观察细胞凋亡情况、流式细胞仪检测细胞凋亡。以同样浓度作用细胞48 h,Western-blot检测cleaved Caspase-3蛋白表达情况。结果 (4-10)μmol/L的BMS-345541均可抑制MG63细胞的增殖,其抑制效应呈剂量-时间依赖性,48 h最低存活率只有(0.412±0.024)(P<0.05)。PI染色荧光显微镜观察结果发现:随药物浓度增高,相同视野下正常细胞数逐渐降低,凋亡细胞数逐渐增高。流式细胞仪分析:0、2、4、8μmol/L的作用BMS-345541 24 h后,凋亡率分别为(5.2±0.78)%、(5.82±0.82)%、(8.86±1.71)%、(11.01±2.69)%,与对照组相比,8μmol/L组差异有统计学意义(P<0.05)。Western blot结果显示MG 63细胞中的cleaved caspase-3蛋白表达量上调,与对照组相比,2、4、8μmol/L组差异均有统计学意义(P<0.05)。结论 BMS-345541可抑制MG63细胞增殖,并诱导其发生凋亡,其作用机制可能与cleaved caspase-3表达上调有关。

沙利度胺抑制骨肉瘤细胞U2OS迁移和侵袭

目的观察沙利度胺对人骨肉瘤细胞U2OS迁移和侵袭的作用,并初步探讨其作用机制。方法分别用不同浓度沙利度胺处理人骨肉瘤细U2OS,采用划痕实验检测沙利度胺对细胞迁移的影响,Transwell小室检测沙利度胺对细胞侵袭的影响,q RT-PCR检测不同浓度沙利度胺作用于细胞后VEGFA、HIF1α和OPN基因的变化,蛋白免疫印迹检测沙利度胺对细胞VEGF、HIF1和OPN蛋白的作用。结果 50、100、200μg/m L沙利度胺作用于U2OS后,划痕实验中沙利度胺组细胞迁移距离明显少于对照组,沙利度胺作用12 h,其迁移距离分别为24 h对照组的(62.36±12.41)%、(57.89±11.23)%和(49.47±6.90)%;作用24 h,其迁移距离分别为24 h对照组的(62.36±12.41)%、(57.89±11.23)%和(49.47±6.90)%。侵袭实验中显示沙利度胺组穿膜细胞数量对比对照组减少,其比率分别为(83.49±2.10)%、(70.64±2.86)%和(50.46±1.59)%。q RTPCR显示50、100、200μg/m L沙利度胺作用于U2OS 24 h后VEGFA、HIF-1α和OPN表达与对照组比较降低,VEGFA m RNA表达量分别为(2.50±0.25)%、(11.75±0.2)%和(6.51±0.01)%;HIF-1αm RNA表达量分别为(34.33±0.42)%、(46.33±1.06)%和(42.60±1.46)%;OPN表达量分别为(86.33±1.8)%、(52.07±1.29)%和(40.06±1)%。蛋白免疫印结果显示VEGFA、HIF-1α和OPN表达与对照组比较降低:与对照组VEGFA表达量1.06±0.06相比,药物组分别为0.88±0.01、04±0.02和0.62±0.01;与对照组HIF-1α表达量0.71±0.01对比,药物组分别为0.69±0.01、0.49±0.01和0.39±0.01;与对照组OPN表达量1.07±0.01对比,药物组分别为1.04±0.01、0.96±0.01和0.6±0.01。结论沙利度胺抑制骨肉瘤细胞U2OS迁移侵袭,其机制与降低细胞内VEGFA、HIF-1α和OPN有关。

新型钌(Ⅱ)配合物抑制人骨肉瘤U-2OS细胞增殖及其机制

目的研究新型钌（Ⅱ）多吡啶配合物[Ru（dmp）2Nadpip]（Cl O4）2（Ru 1）对人骨肉瘤U-2 OS细胞增殖抑制及相关机制。方法 MTS法检测细胞增殖抑制情况,DAPI染色观察细胞吸收Ru1作用部位情况,Hoechst-33258染色观察Ru1作用后细胞核的形态变化,流式细胞仪检测细胞凋亡和细胞周期情况。结果 （6.25~100.00）μmol/L的Ru 1均能不同程度抑制骨肉瘤细胞增殖,其24、48、72 h半数抑制浓度（IC50）分别为113.26、45.52、41.00μmol/L,对骨肉瘤细胞增殖抑制作用呈时间-剂量依赖关系。细胞吸收结果显示Ru 1能进入细胞质,聚集并作用于细胞核内。药物处理后的细胞经Hoechst-33258染色,细胞核出现致密浓染,或呈碎块状致密浓染。100.0、50.0、25.0μmol/L Ru 1作用于细胞48 h后的凋亡率分别为（38.51±3.72）%、（21.13±2.03）%、（11.75±2.54）%,与对照组比较,差异均有统计学意义（P〈0.05）。流式检测药物作用后的U-2 OS细胞呈现G0/G1期阻滞,并呈时间-剂量依赖效应。结论 Ru 1能抑制U-2 OS细胞增殖,诱导其发生凋亡并呈现G0/G1期阻滞,均与时间、剂量正相关。

骨肉瘤长链非编码RNA基因芯片检测及差异分析

目的采用长链非编码RNA(lncRNA)芯片检测在骨肉瘤与瘤旁组织中lncRNA表达谱,分析差异表达的lncRNA,探讨其功能。方法利用lncRNA芯片筛查2010年至2012年期间广州市第一人民医院和南部战区总医院7对骨肉瘤组织与瘤旁组织中lncRNA表达谱,实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)验证芯片结果;分层聚类和火山图分析特征性表达lncRNA,结合基因本体论数据库(GO)分析和通路分析探讨lncRNA参与肿瘤细胞的生物过程。使用Agilent Array平台对样品进行微阵列分析。Agilent Feature Extraction软件分析采集阵列图像。GeneSpring GX v11.5.1软件包进行分子标准化和随后数据处理。采用重复测量设计的方差分析评价各组之间的变化,多组间比较采用单因素方差分析。结果筛选得到7组瘤组织中差异lncRNA总数为4221个,其中上调的1995个,下调的2226个;RT-qPCR验证结果与lncRNA结果基本一致;分层聚类分析显示骨肉瘤组织(T)和瘤旁组织(C)中的lncRNA表达差异有统计学意义;GO分析显示lncRNA广泛参与细胞的生物过程,还参与细胞的细胞器组成。结论lncRNA芯片能有效检测骨肉瘤组织差异性表达的lncRNA,结合分子生物学分析技术发现lncRNA参与骨肉瘤细胞多种生物活性过程。

成骨诱导双基因共表达腺病毒载体的构建

目的探讨用一条Link序列T2A连接骨形态发生蛋白-2（BMP-2）基因与碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）基因构建含目的基因的腺病毒载体的可行性。方法先从cDNA中扩增得到全长BMP-2和bFGF基因片段．再接于Link序列T2A的两端，通过T2APeptide的互补，延伸得到BMP2-T2A—bFGF的全长PCR产物，利用上游引物的BglⅡ酶切位点和下游引物的EcoRV酶切位点将其插入到pShuttle—IRES载体中，酶切、测序鉴定；利用同源重组技术将目的基因表达框从穿梭质粒转移到腺病毒载体，鉴定阳性克隆；将PacI线性化后的腺病毒载体转染到293A细胞，观察GFP表达，PCR鉴定后进行大量扩增，并用CsCl梯度离心法进行纯化；测量A260计算病毒感染滴度。结果克隆得到的BMP-2与bFGF基因测序正确，经BglⅡ和EcoRV双酶切得到的BMP2-bFGF2个基因全长序列完全克隆到穿梭质粒和重组腺病毒载体质粒中；转染293A细胞2周后观察到明显的GFP聚集表达，即病毒包装成功，扩增纯化后滴度为3．6×10^11 VP／ml。结论经酶切鉴定BMP-2与bFGF双基因共表达腺病毒载体构建成功。

成人骨髓间充质干细胞的体外分离培养与鉴定

目的对成人骨髓间充质干细胞（hBMSCs）进行体外分离培养与鉴定，研究其生物学特性。方法将密度梯度离心法获得的单个核细胞，用贴壁培养法分离纯化、扩增获得大量hBMSCs，观察细胞形态，分析细胞生长特性，并经流式细胞仪检测细胞表面抗原、细胞周期，和进行成骨诱导鉴定。结果经密度梯度离心和贴壁培养法可成功分离纯化、扩增得到大量hBMSCs，其细胞形态、分化特性和表型均符合干细胞特点，在特定培养条件下能向成骨细胞分化。结论骨髓间充质干细胞分离扩增容易，细胞增殖能力和成骨性能好，是骨组织工程理想的种子细胞。

重组腺病毒体外诱导山羊骨髓间充质干细胞成骨分化的研究

目的探讨腺病毒介导骨形态发生蛋白2（BMtr2）和碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）双基因体外转染山羊骨髓间充质干细胞（BMSCs）后目的基因表达与诱导成骨情况。方法从2岁健康雌性山羊髂骨处骨穿抽取骨髓2ml，利用密度梯度离心法分离培养山羊BMSCs，将前期构建好的腺病毒载体Ad—BMP2一bFGF、Ad—BMP2分2组，以MOI=5000分别转染BMSCs，每2d用ELISA法检测BMP2和bFGF的表达情况，每周用ALP染色试剂盒及定量试剂盒检测ALP表达情况。结果Ad—BMP2-bFGF转染BMSCs48h后，目的蛋白已有显著表达（BMP2为3996．22pg／ml、bFGF为1352．15pg／m1），第6天达到高峰（BMP2为5146．63Pg／ml、bFGF为1434．75Pg／m1），与未转染组比较差异有统计学意义（P〈0．05），3周后细胞呈现明显的成骨改变,All。P活性明显增高（266mol／L），Ad—BMP2-bFGF组ALP表达量约为Ad—BMP2组的1．5倍（P〈0．05）。结论经Ad—BMP2-bFGF转染的BMSCs具有持续高水平目的蛋白表达活性，转染后的BMSCs表现出明显的成骨活性．成骨活性明显强于Ad—BMP2组。

新型钌（Ⅱ）配合物抑制骨肉瘤MG-63细胞增殖并诱导其凋亡

【摘要】目的通过体外实验探讨新型钌（Ⅱ）多吡啶配合物△-[Ru（phen）2MCMIP]2＋（△-1）对人骨肉瘤细胞MG-63株增殖及凋亡作用。方法CCK-8法检测经0．00、12．50、25．00、50．00、100．00、150．00Ixmol／LA-1作用24、48、72h后，MG-63细胞的增殖情况；流式细胞术检测经0．00、25．00、50．00、100．00μmol／LA-1作用24h后，MG-63细胞的凋亡及周期变化。结果A．1可明显抑制人骨肉瘤MG-63细胞增殖，并呈明显剂量和时间依赖性；24、48、72hICs0分别为57．80μmol／L、45．27Ixmol／L、32．51μmol／L；流式细胞术检测得不同浓度△-1作用24h后，细胞早期凋亡比例从（1．06±0．12）％上升至（37．10±1．25）％，细胞周期被阻滞在G0／G1期。结论Δ-1能抑制MG-63细胞增殖，诱导细胞凋亡，并将细胞周期阻滞在G0／Gl期。

钌（Ⅱ）多吡啶配合物诱导骨肉瘤细胞凋亡及其机制

目的研究钌（U）多吡啶配合物[Ru（dmb）2（DBHIP）]（C104）2对人骨肉瘤MG-63细胞凋亡的诱导作用及机制。方法在培养液体系中加入不同浓度的钌（Ⅱ）多吡啶配合物对骨肉瘤MG-63细胞进行诱导，以CCK-8计数法测细胞生长曲线、细胞集落形成法观察细胞生长抑制情况，流式细胞仪检测细胞周期和细胞凋亡情况，Hoeehst-33258染色观察细胞核的形态变化。结果发现（6．25-100）μmol／L钌（Ⅱ）多吡啶配合物均能不同程度抑制骨肉瘤细胞增殖，其半数致死浓度（LD50）为（66．10±0．228）μmol／L，对骨肉瘤细胞生长有抑制作用呈时间和剂量依赖关系，作用96h后最高抑制率达80．2％。50．0、25．0、12．5μmol／L钌（Ⅱ）多吡啶配合物作用于细胞24h后的凋亡率分别为（71．43±9．99）％、（57．634±2．78）％、（24．07±3．83）％，与对照组（3．30±0．33）％比较，差异均有统计学意义（P〈0．05）；流式检测药物作用后的骨肉瘤细胞，呈现G1／G0期阻滞，并呈剂量依赖效应，浓度越高细胞处在G1／G0期的比例越高。药物处理后的细胞经Hoechst-33258染色，细胞核出现浓染致密的固缩形态和颗粒状荧光。结论钌（Ⅱ）多吡啶配合物能够诱导人骨肉瘤细胞发生凋亡，呈现G1／G0期阻滞，与时间、剂量正相关。