羊痘诊断和预防的研究进展

羊痘又名羊“天花”,是所有动物痘病最为严重的一种,严重影响国际贸易和养羊业的发展。本文主要从羊痘的诊断和预防疫苗方面做一综述。现在已有了一组针对羊痘的简单而高效检测方法和诊断试剂用于实验室诊断,但各有千秋。目前控制该病最有效的方法还是使用高效疫苗对易感动物进行免疫接种。利用羊痘病毒基因组做载体构建重组疫苗来同时预防小反刍兽的其他疾病,具有很大的潜力。

基于TaqMan探针的猪圆环病毒1型实时荧光定量PCR检测方法的建立

采用PCR方法克隆了猪圆环病毒1型(PCV1)ORF2基因,构建了重组质粒pMD-ORF2并将其作为标准阳性模板。通过对反应条件进行优化,以定量的10倍系列稀释的质粒pMD-ORF2为标准品进行荧光定量PCR扩增,建立了检测PCV1的荧光定量PCR方法。结果显示,该方法的检测灵敏度可达1.0×101拷贝/μL;对起始浓度为1.0×107、1.0×106、1.0×105拷贝/μL标准品的最终实际测得值分别为1.001×107、0.869×106和0.988×105拷贝/μL,变异系数分别为4.758%、1.865%和3.836%。表明,此方法具有良好的准确性和重现性。

猴B病毒gB基因在昆虫细胞中的表达

目的研发猴B病毒ELISA检测试剂盒中替代全病毒的抗原。方法根据已报道的猴B病毒E2490株gB蛋白基因序列(GenBank登录号:AF533768)人工合成gB基因,通过XbaⅠ和EcoRⅠ特异性酶切,将gB基因克隆于昆虫杆状病毒表达载体pFastBacHTA,经PCR、酶切、测序鉴定后,成功构建了携带gB基因的重组质粒pFastBac-HTa-gB。结果该重组质粒转化含有杆状病毒穿梭载体的DH10BAC感受态细胞,经抗生素、PCR筛选,获得转座的杆粒bacmid-gB。在脂质体介导下转染sf9昆虫细胞,细胞变大变圆细胞核扩大,收获重组杆状病毒,再感染细胞,收获目的蛋白。通过SDS-PAGE和Western blot分析及间接免疫荧光检测,结果表明该蛋白得到表达,且具有良好的生物活性,大小约为98kDa。实验结果表明已成功构建了携带目的基因的重组质粒pFastBac-HTa-gB和转座的杆粒bacmid-gB,转染后在sf9昆虫细胞上得到表达。结论研究结果为下一步以表达的gB蛋白为诊断抗原,替代现阶段以病毒作为抗原的猴B病毒ELISA检测试剂盒的研制奠定了基础。

猪圆环病毒2型ORF2和ORF1-2串联基因重组腺病毒对小鼠的免疫效果

为了研究含有猪圆环病毒2型(porcine circovirus type2,PCV2)基因的重组腺病毒作为基因工程疫苗的潜在应用价值,利用本实验室构建的PCV2的ORF2和ORF1-2串联基因的重组腺病毒对小鼠进行了免疫并对其免疫效果进行了研究。分别用表达ORF2和OFR1-2基因的重组腺病毒Ad-ORF2、Ad-ORF1-2经肌肉途径免疫Balb/c小鼠,对免疫后小鼠的血清抗体和脾淋巴细胞中各细胞亚群的比例及其增殖反应、自然杀伤活性和特异性杀伤活性进行了检测和比较。结果表明,用表达ORF2基因和ORF1-2串联基因的重组腺病毒Ad-ORF2、Ad-ORF1-2经肌肉途径免疫Balb/c小鼠后,随着免疫次数的增加,小鼠产生的针对PCV2ORF2基因的特异性抗体水平不断升高,第3次免疫后2周达到最高,但第3次免疫后4周有所下降;免疫重组腺病毒的试验组小鼠的脾淋巴细胞增殖活性、CTL杀伤活性和NK细胞杀伤活性与免疫空载体的对照组和免疫PBS的对照组比较均有显著的差异(P<0.05)。本研究为PCV-2基因工程疫苗的深入研究及应用奠定了基础。

H5亚型禽流感病毒血凝素蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

用纯化的H5亚型禽流感病毒(AIV)抗原免疫Balb/C小鼠,取免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,经筛选,获得9株稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株,其中4株能高效分泌血凝素(HA)蛋白特异性的单克隆抗体.特异性试验表明,IE6单克隆抗体仅与试验的H5病毒株反应,而不与新城疫病毒(NDV)、H9亚型AIV和产蛋下降综合症病毒(EDSV)反应.这9株单克隆抗体分别为IgG1、IgG2a、IgG2b、IgM亚类,κ轻链.

口蹄疫病毒3B基因的高效表达及其表达产物的反应活性

通过PCR技术获得口蹄疫病毒非结构蛋白3B基因,将其克隆至质粒pET-32a(+)和高效可溶性表达质粒pEM中,经PCR筛选,获得阳性重组子pET-3B和pEM-3B,将它们转化大肠杆菌BL21中进行诱导表达,SDS-PAGE及Western-blot检测结果证明,表达的3B融合蛋白能与FMDV感染动物血清发生特异性反应。蛋白可溶性分析表明,EM-3B融合蛋白绝大部分以可溶形式表达。以此可溶性融合蛋白EM-3B为抗原建立了可区分FMD免疫动物和感染动物的EM-3B-DIVA-ELISA方法,经检测,其特异性为95.0%,敏感性为97.5%,与2个国产试剂盒的符合率分别为96.25%和98.75%。

列车分级控制方式对地铁列车最小间隔之影响分析

本文将结合北京地铁2号线的设计,重点分析采用一次模式制动曲线控制方式和速度分级控制方式对列车最小间隔时分的影响。

荧光定量RT-PCR检测猪日本脑炎病毒

通过RT-PCR方法克隆了日本脑炎病毒(JEV)N基因片段序列,构建重组质粒作为标准阳性模板,同时根据GenBank中的靶序列设计了荧光定量RT-PCR的1对引物和1条TaqMan探针。通过条件优化,以定量的10倍系列稀释的质粒为标准品进行荧光定量PCR扩增并制作标准曲线,建立了JEV检测的荧光定量PCR方法。结果表明,该方法检测灵敏度可达1.0×100拷贝/μL,线性范围为109～100,达10个数量级;对起始浓度为1.0×109、1.0×108和1.0×107拷贝/μL的标准品的最终实际测得值(Ct)分别为17.33、20.52和23.90,变异系数分别为0.54%、0.74%和0.53%,均小于5%。对阳性组织病料的检测表明该方法的灵敏度高出常规PCR,与套式PCR(nested-PCR,nPCR)具有相近的灵敏度。

华南地区猪圆环病毒1型与2型感染情况调查及相互关系

根据已发表的猪圆环病毒1型(PCV-1)与猪圆环病毒2型(PCV-2)的全基因组序列,设计4对特异性引物,用套式PCR方法对广东地区的规模养猪场或个体养殖户送检的144份猪血清进行了PCV- 1与PCV-2病毒检测。结果显示PCV-1阳性血清21份,PCV-2阳性血清40份,PCV-1与PCV-2均为阳性的血清7份,PCV-1阳性率为14.6％,PCV-2阳性率为27．8％;PCV-1与PCV-2均为阳性的阳性率为4．9％,从数据上的比较可知PCV-2的感染率高于PCV-1的感染率。说明PCV-2感染比较普遍,患病猪群中也存在一定比例的PCV-1病毒感染。

铁路干线提速对信号设计应考虑的几个问题

从信号显示数、确定闭塞分区长度、装备速度监控设备及采用多信息轨道电路四个方面阐述了因铁路干线提速而对信号改造时应考虑的几个问题：

环状病毒基因组电泳图谱计算机自动分析系统

本研究建立了环状病毒基因组电泳图谱的计算机自动分析系统,它在环状病毒病的检疫、定性和定型鉴定以及分子流行病学研究等方面有重要应用价值。