免疫磁珠富集水中鲤春病毒血症病毒的初步研究

为建立一种富集水中鲤春病毒血症病毒(SVCV)的技术,本研究利用SVCV多克隆抗体制备免疫磁珠,通过对磁珠耦联抗体量的优化,确定该免疫磁珠有效富集SVCV的最低浓度,建立一种富集SVCV的免疫磁珠分离技术,并联合荧光定量RT-PCR(RT-qPCR)技术对水中SVCV进行检测。结果显示,1 mg磁珠与75μg SVCV多克隆抗体耦联时,耦联的抗体量最大,耦联率为98.48%;耦联后的免疫磁珠对SVCV(200μL,浓度为1.54×10^(6)拷贝/μL)的富集效率最高为91.56%。以该多克隆抗体量制备的免疫磁珠富集10倍倍比稀释的SVCV(3.54×10^(6)拷贝/μL~3.54×10^(3)拷贝/μL),以确定其有效富集SVCV的最低浓度。结果显示,1 mg免疫磁珠能够使200μL病毒液(3.54×10^(3)拷贝/μL)富集率达到61.58%。表明该免疫磁珠能够有效富集SVCV。在免疫磁珠分离技术联合RT-qPCR技术检测水样品中SVCV(浓度约为1.16×10^(4)拷贝/μL)的结果显示,免疫磁珠组富集SVCV核酸量是裸磁珠组富集SVCV核酸量的1.77×10^(3)倍,是未处理组富集SVCV核酸量的1.68×10^(3)倍,免疫磁珠组富集SVCV均极显著高于裸磁珠组和未处理组(P<0.01),裸磁珠组富集的SVCV与未处理组则无显著差异(P>0.05)。本研究首次建立了一种能够有效富集水中SVCV的方法,为SVCV的监测提供了技术手段。

2022年宁波市南美白对虾主要病原流行病学调查

为了解虾肝肠胞虫(EHP)、十足目虹彩病毒1(DIV1)、白斑综合征病毒(WSSV)和致急性肝胰腺坏死病副溶血弧菌(Vp AHPND)在宁波地区养殖南美白对虾中的致病途径和流行规律,采用PCR方法检测了该地区不同养殖模式下南美白对虾及其周边环境和生物中这4种病原的感染情况。结果显示:南美白对虾样本中,WSSV在整个养殖过程中未检出,Vp AHPND阳性率最高,为14.6%,其次是EHP和DIV1,阳性率分别为10.2%和2.9%;土塘养殖模式下对虾病原检出率最高,为61.3%,其次为小棚模式和帆布池模式,病原检出率分别为26.3%和22.2%,大棚养殖的南美白对虾中未检出病原;水样中检出WSSV、EHP、Vp AHPND、DIV1阳性批次数分别为1、14、8、6;底泥样品中未检出病原;周边环境生物中,仅1个批次的脊尾白虾检出EHP阳性。结果表明:4种病原在夏季有较强的流行趋势,需要针对性地加强防控;大棚养殖模式的抗风险能力要高于其他养殖模式,在该模式下水质相对稳定,受外界因素影响较小;病原在底泥和周边环境生物中检出率较低,而在养殖水体中检出率较高,养殖水体可能在南美白对虾感染病原的过程中起着重要的传播媒介作用。因此,在养殖过程中加强水体调控十分重要。

可口革囊星虫肠道产蛋白酶菌株的筛选及鉴定

为分离鉴定可口革囊星虫(Phascolosoma esculenta)肠道细菌,获得产蛋白酶菌株,以野生和养殖可口革囊星虫为材料,通过常规细菌培养获得部分肠道菌群,利用脱脂乳蛋白培养基筛选产蛋白酶的菌株,采用16S r RNA对其种属进行鉴定,并测定其蛋白酶活力。结果表明,从野生可口革囊星虫肠道分离得到5株产蛋白酶菌株,其中WE6属于弧菌属(Vibrio),WE16属于盐芽孢杆菌属(Halobacillus),WG4和WP1属于芽孢杆菌属(Bacillus),WP2属于微球菌属(Micrococcus);从养殖可口革囊星虫肠道分离得到6株产蛋白酶菌株,其中CE4属于微球菌属,CE5、CE11及CP6属于芽孢杆菌属,CE17属于希瓦氏菌属(Shevagella),CP7属于寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)。各菌株蛋白酶活力测定结果显示,水解圈直径与其相关性最大,pearson相关系数为0.628。野生和养殖可口革囊星虫肠道中占据优势的产蛋白酶细菌均为芽孢杆菌属;其中微球菌属和芽孢杆菌属产蛋白酶活力较高。

虾类十足目虹彩病毒1(DIV1)LAMP-HNB快检方法的建立

[目的]建立一种操作简便、快速、可视化的虾类病原检测方法,实现基层养殖户自检。[方法]针对十足目虹彩病毒1(DIV1),设计环介导等温扩增(LAMP)特异性引物,对反应试剂用量、温度、反应时间等条件进行优化,建立LAMP与羟基萘酚蓝(HNB)结合的LAMP-HNB可视化快速检测方法。[结果]在LAMP反应体系中添加12 mmol/L Mg^(2+)和250μmol/L HNB,65℃恒温条件下反应60 min最佳;DIV1病原质粒最低检出限为102 copies/μL,稳定性和特异性较好,通过带有靶标基因的阳性质粒进行16次重复性试验结果均较为稳定,多种模板扩增试验均未发生假阳性情况,符合试验要求。[结论]该研究建立的LAMP-HNB可视化快速检测方法,适用于上述对虾DIV1的现场快速检测。

宁波市水产养殖用药减量现状及对策

水产养殖用药减量行动是推进我国水产养殖业转型升级、绿色高质量发展的迫切需求。2019年十部委联合发文《关于加快推进水产养殖业绿色发展的若干意见》中明确把用药减量行动作为推进水产养殖业绿色发展的重要举措,农业农村部已连续4年(2020-2023年)将水产绿色健康养殖“五大行动”列入重点工作。为此,宁波市深入开展水产养殖用药减量调研,总结了近年来我市水产养殖用药减量工作成效.

唐鱼Caspase-3和Caspase-9 cDNA全长克隆及胁迫表达分析

研究以唐鱼(Tanichthys albonubes)鳃部组织为材料,利用同源克隆和RACE方法,首次克隆得到唐鱼Caspase-3和Caspase-9 cDNA全长序列,并对其生物信息学进行了分析和鉴定。实验结果表明唐鱼Caspase-3 cDNA全长2153 bp,开放读码框(Open Reading Frame,ORF)为840 bp,编码一段长为279个氨基酸的多肽序列;Caspase-9 cDNA全长为1758 bp,ORF为1323 bp,编码440个氨基酸。生物信息学分析表明Caspase-3和Caspase-9与其他鱼类在蛋白结构上较为保守,在重要的功能域呈现高度的保守性。应用实时荧光定量PCR技术,分析了氯氰菊酯对唐鱼鳃部组织表达Caspase-3和Caspase-9的影响,在氯氰菊酯的胁迫下,Caspase-3和Caspase-9的表达呈现抑制状态,且呈现明显的浓度和时间依赖效应。

淡水育珠蚌的RNA提取与RT-PCR分析

介绍了一种适用于淡水育珠蚌的高质量RNA提取方法,并进行RT-PCR分析,具有简便快速、适用性广等特点。

磁珠快速核酸提取法在南美白对虾病原检测中的应用及其性能评价

为实现南美白对虾相关病原核酸快速、便捷提取,并实现原材料国产化,降低成本,建立了一种基于国产磁珠的核酸快速提取方法(以下简称磁珠法).以携带虾肝肠胞虫的南美白对虾为实验样本,通过微流控芯片对3种磁珠提取的核酸进行测试,并对裂解液中盐酸胍浓度及洗涤液2中乙醇浓度进行了优化.通过优选实验确定:奥润磁珠提取效果优于其他两种磁珠;裂解液中盐酸胍的最佳浓度为4 mol·L^(-1);洗涤液2中乙醇的最佳质量分数为75%.在此基础上,分析评价了优化后的磁珠法核酸提取线性范围、灵敏度、精密度、特异性及抗干扰能力等技术性能.结果显示:稀释10^(4)倍后的低浓度病原核酸仍保持较好的扩增效果,变异系数为2.03%,表明建立的磁珠法具有较宽的检测范围,灵敏度高,特异性和抗干扰能力强.本文建立的磁珠法可实现快捷、通用、高纯度、低成本的南美白对虾主要病原的核酸提取.

大海马转化生长因子β1(TGF-β1)基因的克隆鉴定及功能研究

转化生长因子β1(Transforming growth factor-β1,TGF-β1)是一种多效应细胞因子,在免疫系统中,成熟的TGF-β1多肽是一种强有力的细胞分化调节剂和免疫调节剂。本研究通过基因克隆得到了大海马(Hippocampus kuda)TGF-β1 cDNA全长序列(GenBank登录号为HM564035),全长为1 941 bp,开放阅读框为1 161 bp,编码1种含386个氨基酸的多肽。同源性分析表明,大海马TGF-β1与斜带石斑鱼TGF-β1的亲缘关系最近。Real-time PCR结果显示,TGF-β1基因在健康大海马肾中表达量最高,其次是肝、大脑、小脑、皮肤、中脑、卵巢,在鳃和肠道中表达很少,在心脏和肌肉中检测不到表达。大海马TGF-β1重组蛋白在TNT快速偶联的转录/翻译系统中高效表达,用BS3交联后形成了大量的可溶性二聚体蛋白,Western blot检测结果显示该重组蛋白具有良好的免疫学活性。利用得到的大海马rTGF-β1刺激HeLa细胞,结果显示刺激细胞中TGF-β1下游Smad信号通路中的Smad3、Smad4基因表达量上升,Smad7基因表达量下降,表明所得到的大海马TGF-β1重组蛋白具有特定的生物活性,能够诱导人细胞中Smad信号通路的活化,延续了TGF-β1蛋白功能的保守性。

斜带石斑鱼转化生长因子β1(TGF-β1)基因的克隆及表达分析

转化生长因子β1(TGF-β1)是一种高度保守的多效细胞因子。通过分子克隆得到了斜带石斑鱼Epi-nephelus coioidesTGF-β1 cDNA全长序列,全长为2 477 bp,开放阅读框为1 161 bp,编码一种含386个氨基酸的多肽。Realtim e PCR分析表明,TGF-β1基因在健康斜带石斑鱼所取组织中均有表达,肾脏中表达最高,其次是头肾和脾脏。用PolyI:C或ConA刺激斜带石斑鱼头肾淋巴细胞,TGF-β1表达量明显上升,且在刺激4 h后达到最高值。用PolyI:C刺激16、24 h后,TGF-β1几乎不表达,而用ConA刺激实验组,TGF-β1表达量一直高于对照组。结果说明,斜带石斑鱼TGF-β1基因结构和表达特征与其他硬骨鱼类具有高度相似性。

海水池塘“跑道”养鱼技术

“跑道”养鱼是基于“循环、生态、低碳、环保”理念发展出的全新水产养殖新模式,在池塘内配备推水增氧装置和流水养殖槽,使跑道内的水循环流动,定期将鱼排泄物、饲料残渣分离出养殖水体,实现了经济效益与生态效益“双丰收”。宁波市海洋与渔业研究院开展海水“跑道”养鱼探索,经过两年的养殖和研究,取得了较好的效果,现将养殖情况总结如下。

大黄鱼网箱筏架吊笼养殖长牡蛎试验

大黄鱼(Larimichthys crocea),隶属于硬骨鱼纲(Osteichthyes),鲈形目(Perciformes),石首鱼科(Sciaenidae),黄鱼属(Larimichthys),是近海集群暖温性洄游鱼类,素有海水“国鱼”的美誉,主要分布于我国黄海南部、东海和南海等海域。20世纪80年代后期,随着养殖技术的突破,大黄鱼养殖业在我国福建、浙江、广东、江苏等沿海省份相继发展起来,象山港作为浙江省最早的大黄鱼养殖区域,网箱养殖是其最主要的养殖方式。

宁波水产种业高质量发展对策研究

浙江省宁波市围绕主导养殖品种,着力推动种质资源保存与开发利用,打造出具有鲜明地方特色的水产种业新局面。本文介绍了宁波市水产种业发展现状,剖析了目前制约水产种业高质量发展的主要因素,结合经济和社会发展需要,提出了提升政策支持、健全资金保障、强化科研支撑和完善推广服务等对策建议,以期为其他地区发展水产种业提供参考。

银鲳室内微流水养殖技术研究

银鲳是我国东部沿海主要的海水经济鱼类之一,其养殖技术一直是业内公认的难题。本文围绕银鲳室内微流水养殖模式,重点介绍了银鲳苗种放养、水质管理、饵料投喂和病害防治等日常管理技术措施,旨在为推动银鲳的养殖产业化发展提供参考。银鲳(Pampus argenteus)属鲈形目(Perciformes)、鲳科(Stromateidae)、鲳属(Pampus),为暖水性中下层集群性鱼类,主要分布于印度洋和太平洋西部,我国东海与南海较多。其因肉厚、刺少、味佳且营养丰富,市场需求十分旺盛。20世纪90年代以来,受海洋环境破坏和捕捞强度增强的影响,东海银鲳自然资源衰退明显。因此,银鲳作为海水养殖的重要候选品种,其养殖技术受到了社会的广泛关注。

2020—2022年宁波市大黄鱼病原菌耐药状况分析

为掌握近几年宁波市大黄鱼主要病原菌的种类及其耐药趋势,本研究于2020—2022年在宁波市大黄鱼主要养殖基地采集患病鱼体进行病原菌的分离鉴定,并对分离的病原菌进行恩诺沙星、硫酸新霉素、甲砜霉素、氟苯尼考、盐酸多西环素、氟甲喹、磺胺间甲氧嘧啶钠、磺胺甲噁唑+甲氧苄啶8种抗菌渔药最低抑菌浓度(Minimum inhibitory concentration,MIC)的测定,比较各病原菌对药物的感受性。结果表明,近3年从大黄鱼体内共分离到7种、58株病原菌,主要病原菌为杀香鱼假单胞菌、哈维氏弧菌和鰤鱼诺卡氏菌,占总菌株数的74.1%,其中哈维氏弧菌和鰤鱼诺卡氏菌每年都有被分离到。100%分离的菌株对盐酸多西环素敏感,所有菌株对该药物的感受性均分布在MIC≤4.00 mg/L,耐药率为0%;相较而言,病原菌对氟苯尼考及磺胺类药物的耐受浓度较高,尤其磺胺类药物MIC普遍为64.00~1024.00 mg/L。另外,从病原菌耐药性年度变化可知,鰤鱼诺卡氏菌每年对药物的耐受性呈逐年递增的趋势。因此,虽然病原菌普遍对盐酸多西环素、硫酸新霉素、恩诺沙星敏感,其可作为防治大黄鱼多数病原菌的优选药物,但必须严格按照药敏试验结果及结合药代学、药效学确定剂量和药程,才能尽可能避免耐药菌株的产生。

亚硝酸盐对携带虾肝肠胞虫的凡纳滨对虾的影响分析

为研究亚硝酸盐胁迫对凡纳滨对虾的生长状况及虾肝肠胞虫(EHP)携带量的影响,探索亚硝酸盐、EHP和对虾生长三者之间的内在联系.本试验以南美白对虾为试验动物,每天调节一次水体中的亚硝酸盐含量,维持实验设定亚硝酸盐水平;每10天取一次样,统计死亡率,测定虾的生长指标和EHP携带情况.结果表明:1)亚硝酸盐10 mg/L组具有抑制EHP感染和传播的趋势,整体来看,对虾EHP携带率表现为空白组>亚硝酸盐20 mg/L组>亚硝酸盐10 mg/L组;2)EHP携带的试验虾,存活率由高到低表现为:亚硝酸盐10 mg/L>空白组>亚硝酸盐20 mg/L;3)亚硝酸盐10 mg/L组对感染EHP对虾的生长有一定的促进作用,亚硝酸盐10 mg/L组的试验虾规格大于其他两组.

氨氮胁迫对凡纳滨对虾的生长状况及虾肝肠胞虫(EHP)携带量的影响

以凡纳滨对虾为研究对象,设置0.1 mg/L(空白组)和6.0(试验组Ⅰ)、9.0 mg/L(试验组Ⅱ)3个氨氮浓度组,研究氨氮胁迫对其生长状况及虾肝肠胞虫(EHP)携带量的影响。结果表明,氨氮对EHP的影响有一定的时间-剂量效应,随着时间的增长,凡纳滨对虾EHP感染率呈上升的趋势;9.0 mg/L氨氮可以有效促进感染EHP凡纳滨对虾体长和体重的增长。试验期间,试验组Ⅱ凡纳缤对虾大虾增长率最高,且小虾的比例明显下降。试验组Ⅱ抑制EHP表达的效果优于空白组和试验组Ⅰ。

2020年宁波市主养海水鱼流行病学调查与药敏试验

为了解宁波地区水产养殖品种病害发生情况,本研究于2020年通过定期抽检与应急检测相结合方式,开展了地区性的主要海水鱼流行病学调查工作.从大黄鱼、小黄鱼、七星鲈鱼、银鲳等海水鱼上共分离到细菌19株,主要菌株为哈维氏弧菌和美人鱼发光杆菌;检测出病毒阳性26批次,主要为传染性脾肾坏死病毒和真鲷虹彩病毒;镜检观察到寄生虫2例,分别为东方鱼虱和梅氏新本尼登虫.药敏试验结果显示:从鱼体分离得到的致病菌对盐酸多西环素、氟甲喹敏感2种药物的最小抑菌浓度(MIC)普遍<0.1 mg·L^(-1),因此其可作为优选药物进行细菌病的治疗.另外发现在不同时间段,大黄鱼上分离到的同种细菌对药物的敏感性并不一致.药敏试验结果将有助于养殖户做到科学、精准用药,同时也能为本地水产养殖动物病原菌的耐药性普查工作提供理论基础.

药饵投喂下诺氟沙星在凡纳滨对虾主要组织中的分布及消除规律研究

将诺氟沙星原药(98%)按质量比为1:1 000制成颗粒饵料投喂凡纳滨对虾,研究在养殖模式下诺氟沙星在凡纳滨对虾各组织中的分布及消除规律。采用高效液相色谱法结合药代动力学分析软件3P97分析诺氟沙星在凡纳滨对虾体内的药物回收率、动力学参数、药时曲线等参数。结果表明,诺氟沙星血药浓度时间曲线符合吸收二室模型,动力学方程分别为:C血淋巴=9.236 e-0.662 t+56.938 e-0.01 t-66.174 e-0.985 t,C肌肉=21.491 e-0.576 t+0.328 e-0.047 t-21.819 e-0.726 t,C肝胰腺=30 115.96 e-0.355 t+39.314 e-0.01 t-30 155.274 e-0.378 t。血淋巴、肌肉、肝胰腺中诺氟沙星达峰时间Tmax分别为1 h、4 h和4 h,峰浓度值Cmax分别为13.527 5 mg/L、1.904 4 mg/L和698.916 7 mg/L,表观分布容积V1/F分别为0.017 L/kg、0.210 L/kg和0.001 L/kg,吸收半衰期T1/2Ka分别为0.704 h、0.954 h和1.832 h,分布半衰期T1/2α分别为1.047 h、1.204 h和1.951 h,消除半衰期T1/2β分别为69.315 h、14.812 h和69.315 h,中央室向周边室转运的一级速率常数K12分别为4.347 h-1、0.098 h-1和0.098 h-1,周边室向中央室转运的一级速率常数K21分别为0.629 h-1、0.081 h-1和0.017 h-1,药时曲线下面积AUC分别为6.764 mg·h-1·L-1、9.538 mg·h-1·L-1和7013.467 mg·h-1·L-1。血淋巴、肌肉、肝胰腺组织中诺氟沙星浓度水平的结果表明,诺氟沙星在凡纳滨对虾3种组织中浓度最高的为肝胰腺;肌肉和血淋巴中诺氟沙星代谢较快,在投喂8 h后药物残留接近于零,但肝胰腺组织易蓄积诺氟沙星,其残留时间至16 d才未被检测到。实验实施期间为9月份,平均水温为28℃,因此,使用质量比为1:1 000制成颗粒饵料投喂凡纳滨对虾至少应经过448℃.d后才能消除。

池塘养殖匙吻鲟的生长特性

在宁波市鄞州区环亚水产养殖有限公司的养殖池塘中,通过放养不同密度的匙吻鲟(Polyodon spathula)鱼苗进行养殖试验,并对匙吻鲟生长进行测定。结果表明,放养7~9 cm鱼苗,密度为2.25万尾/hm 2时成活率达63.7%,经5个月的养殖,平均体长达42.12 cm,平均体重达267.31 g,生长指标相对增长率总体呈现下降趋势;对全长、体长及体重进行回归分析,全长(LT)与体重(W)的幂函数方程为W=0.0182 LT^(2.4689)(R^(2)=0.9714),体长(LB)与体重(W)的幂函数方程为W=0.0382 LB^(2.3618)(R^(2)=0.9549),幂函数指数小于3,表明匙吻鲟的生长为体长增长速度快于体重的异速生长。