腺病毒介导的肿瘤血管靶向的体外自杀基因治疗研究

本工作在血管内皮细胞中分别建立了HSV-tk/GCV和EC-cd/5-FC自杀基因系统,用于抑制实体肿瘤中血管生成的研究.构建含自杀基因的重组腺病毒AdCMVtk和AdCMVcd,滴度均1×10^(12)pfu/ml.病毒感染小鼠血管内皮细胞lGll(MOI=100),并鉴定自杀基因的表达,测定原药对它们的杀伤.生长抑制试验表明,GCV对lGll/Ad-tk细胞杀伤的IG_(50)为0.2μmol/ L,5-FC对lGll/Ad-cd细胞杀伤的IC_(50)为20μmol/L.电镜下显示被原药杀伤的血管内皮细胞有明显的细胞凋亡现象.同时混合细胞实验证明两系统均存在明显的旁杀伤效应.从而在体外水平证明了HSV-tk/GCV和EC-cd/5-FC自杀基因系统杀伤增生血管内皮细胞的有效性.

白细胞介素2-绿脓杆菌外毒素融合基因的克隆及高效表达

利用聚合酶链式反应和寡核苷酸介导的定向诱变技术构建了白细胞介素2-绿脓杆菌外毒素IL2-PE40、IL2-PE40KDEL、IL2-PE66^(4Glu)和IL2-PE66^(4Glu)KDEL融合基因的原核表达重组质粒,并实现了高效表达,表达产物占菌体总可溶蛋白的20％～30％。此外,由于这一表达质粒在IL-2cDNA与PE基因连接处引入了唯一的SmaⅠ位点,其5＇、3＇端分别含有唯一的EcoRⅠ、PstⅠ位点,因此可方便地用其它基因替换IL-2或PE基因而获得相应融合蛋白的表达质粒。

CD自杀基因系统对胶质瘤细胞作用的实验研究

将含大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶(EC-CD)基因的重组逆转录病毒感染大鼠神经胶质瘤细胞C6,获得稳定表达CD的克隆细胞C6/CD。CD可以将无毒性的原药5-氟胞嘧啶(5-FC)转化成高度细胞毒性物质5-氟尿嘧啶(5-FU)。生长抑制试验表明C6/CD细胞对5-FC高度敏感,IC_(50)为3μmol/L;5-FC对C6细胞基本无毒性,IC_(50)近6000μmol/L;而C6/CD和C 6细胞均对低浓度5-FU敏感,IC_(50)小于1μmol/L。混合细胞试验表明C6/CD细胞在5-FC存在下对C6细胞有旁杀伤效应。本工作在细胞水平建立了一个治疗神经胶质瘤的自杀基因系统,过去无人报道过。

IL-2-绿脓杆菌外毒素融合蛋白增强杀伤细胞活性

实验证实了白细胞介素２－绿脓杆菌外毒素融合蛋白ＩＬ２－ＰＥ４０ＲＥＤＬＫ、ＩＬ２－ＰＥ４０ＫＤＥＬ、ＩＬ２－ＰＥ６６4GluＲＥＤＬＫ、ＩＬ２－ＰＥ６６4GluＫＤＥＬ对含高亲和力ＩＬ－２受体靶细胞的杀伤效应是借助于ＩＬ－２与其受体的特异性结合和ＰＥ的杀伤活性介导的，而且同一靶细胞对这些融合蛋白的敏感性有较大的差异，对人外周血ＰＨＡ体外活化的淋巴母细胞的杀伤活性，ＩＬ２－ｐＥ６６4GluＫＤＥＬ要比ＩＬ２－ＰＥ４０ＲＥＤＬＫ强约４０倍，还发现若将ＩＬ２－ＰＥ融合蛋白羧基末端的ＲＥＤＬＫ氨基酸突变为ＫＤＥＬ可增强其杀伤细胞的活性，对ＣｏｎＡ活化的小鼠脾母细胞的杀伤活性，ＩＬ２－ＰＥ４０ＫＤＥＬ要比ＩＬ２－ｐＥ４０ＲＥＤＬＫ强８倍。