神经干细胞和多巴胺神经元联合移植对帕金森病大鼠运动障碍的影响

目的探讨神经干细胞和多巴胺神经元联合移植改善帕金森病大鼠运动障碍的效果。方法采用经典6-羟基多巴胺毁损法构建帕金森病大鼠模型36只,腹腔注射阿朴吗啡连续诱导4周。APO注射第4周将36只帕金森病大鼠随机分为对照组、多巴胺组、干细胞组及联合组,每组9只,分别于右侧纹状体区立体定向注入生理盐水、多巴胺神经元悬液、神经干细胞悬液、多巴胺神经元与神经干细胞悬液。计算各组移植后2、4、6、8周的旋转次数;干细胞组及联合组分别于移植后1、2、4、8周行MRI扫描,观察移植区影像学变化;移植后8周取各组脑组织行普鲁士蓝染色,观察移植细胞定植与迁移情况,免疫荧光法检测移植细胞分化情况。结果移植后2、4、6、8周,对照组、神经干细胞组、多巴胺组、联合组旋转次数依次降低,组间两两比较P均<0.01。MRI检查结果:随着时间延长,联合组与干细胞组移植区T2 W/FFE成像上呈低信号影的区域逐渐变大,但联合组低信号影范围大于干细胞组。普鲁士蓝染色结果:干细胞组和联合组移植的神经干细胞及其分化后的细胞胞质内均可见大量蓝色颗粒,大部分存留在移植针孔附近,仅少部分细胞向远处迁移,但联合组蓝色颗粒数量以及扩散范围均大于干细胞组。联合组巢蛋白(Nestin)、酪氨酸羟化酶(TH)、绿色荧光蛋白(GFP)阳性细胞数及Nestin/GFP、TH/GFP均高于干细胞组,酸性纤维蛋白(GFAP)阳性细胞数及GFAP/GFP均低于干细胞组(P均<0.01)。结论神经干细胞与多巴胺神经元联合移植可显著改善帕金森病大鼠的运动障碍,更有助于神经干细胞的定植、迁移及分化成为多巴胺神经元。

Nurr-1对小胶质细胞微环境的影响

目的:探讨Nurr-1基因对小胶质细胞活化状态及其微环境的影响。方法:分离培养新生SD大鼠小胶质细胞,纯化、鉴定并分别用脂多糖(LPS)刺激活化和过表达Nurr1基因。实验随机分为小胶质细胞组、Nurr1过表达组、LPS处理组、Nurr1过表达+LPS处理组。ELISA分析过表达Nurr1基因对不同状态小胶质细胞分泌TNF-α、IL-1等炎症相关因子和BDNF、GDNF和PDNF等神经营养因子的影响。结果:(1)小胶质细胞混合培养、纯化、CD11b/c免疫细胞化学鉴定为阳性,纯度在>95%;(2)Nurr1基因过表达小胶质细胞转染阳性率>90%;(3)ELISA法检测结果显示:过表达Nurr1基因的小胶质细胞显著降低了TNF-α、IL-1的分泌,并促使了BDNF、GDNF和PDNF等神经营养因子的分泌。结论:Nurr1基因可抑制小胶质细胞的活化和减少炎症相关因子的产生,同时可促进GDNF、BDNF、PDNF等与DA能神经元存活和成熟等相关的神经营养因子的分泌。

大鼠胚胎中脑腹侧来源神经干细胞的分离和培养

目的:体外培养大鼠胚胎中脑腹侧来源神经干细胞(NSCs),观察其生长及诱导分化培养特点。方法:取孕12.5~14.5 d的SD大鼠,采用机械分离法获取中脑腹侧组织,剪碎并吹打成单细胞悬液后,以2×10~5个细胞/ml的密度接种到无血清NSCs培养基中以神经球法培养。培养神经球5~7 d后,按原密度进行传代培养,并取第三代培养的神经球用含10%胎牛血清(FBS)分化培养液分化培养,分化培养7 d后行免疫细胞化学鉴定。结果:神经球呈巢蛋白(nestin)阳性,诱导分化后的细胞作分别呈微管蛋白(βIII-Tubulin)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)阳性。结论:经神经球法培养得到的大鼠胚胎中脑腹侧来源神经干细胞可自我增值,并可诱导分化成神经元和胶质细胞。

一种原代小胶质细胞培养与纯化方法的改良

目的建立一种简易高效的新生大鼠小胶质细胞的原代培养和纯化方法,提高小胶质细胞的产量以及纯度。方法在传统Miriam Mecha的混合胶质细胞培养方法的基础上通过改良操作,混合培养小胶质细胞,并分别采用手拍法、摇床法以及温和胰酶消化法,纯化小胶质细胞,通过差速贴壁进一步纯化细胞。荧光显微镜下标记小胶质细胞的特异性标记物Iba1、CD11b/c进行鉴定。结果 (1)分离培养第1天小胶质细胞呈不规则圆形,折光不均匀,继续培养3~5 d,小胶质细胞逐渐出现单极或多极突起,7 d时部分细胞转为静止状态,呈分枝状;(2)纯化后小胶质细胞多呈静息状态,细胞免疫荧光CD11b/c、Iba1双阳性;(3)不同纯化方法细胞免疫荧光并计数显示:手拍法纯化小胶质细胞,细胞阳性率(>96%)明显高于胰酶消化法(>90%,P<0.05),前者细胞产量明显高于摇床法(P<0.05)。结论通过改良传统Miriam Mecha的混合小胶质细胞的培养和纯化方法,可以提高小胶质细胞产量以及纯度。

Nurr1对小胶质细胞联合神经干细胞共培养促进神经干细胞向多巴胺神经元分化作用研究

目的探讨联合过表达核受体相关因子1(Nurr1)基因的小胶质细胞(MG)和神经干细胞(NSC)共培养对神经干细胞向多巴胺神经元分化的影响。方法原代培养SD大鼠神经干细胞和小胶质细胞,并过表达Nurr1基因。CCK-8法检测Nurr1过表达对神经干细胞以及小胶质细胞活率的影响。Transwell系统共培养神经干细胞和小胶质细胞,实验分为NSC组、NSC+MG组和N(NSC+MG)组。ELISA检测共培养后第3天、第6天和第9天各组脑源性神经营养因子(BDNF)、血小板源性神经营养因子(PDNF)和胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)表达变化;RT-PCR和Western Blot检测各组第9天酪氨酸羟化酶(TH)、多巴胺转运蛋白(DAT)DAT和Nurr1的表达变化;细胞免疫荧光鉴定神经干细胞的分化,并对TH和DAT阳性细胞计数,计算各组神经干细胞向多巴胺神经元的分化效率。结果原代培养小胶质细胞以及神经干细胞并成功过表达Nurr1基因。CCK-8法检测结果表明,Nurr1过表达对神经干细胞以及小胶质细胞活率无明显影响。ELISA检测结果表明,N(NSC+MG)组在不同时间点神经营养因子(BDNF、PDNF和GDNF)表达量明显高于其他各组(P<0.05)。RT-PCR和Westen Blot检测结果表明,N(NSC+MG)组TH、DAT和Nurr1的表达水平明显高于其他各组(P<0.05)。细胞免疫荧光鉴定结果表明,N(NSC+MG)组TH阳性细胞率明显高于其他各组(P<0.05)。结论Nurr1基因可促进神经干细胞和小胶质细胞共培养系统神经营养因子的分泌。过表达Nurr1基因的神经干细胞和小胶质细胞共培养可促进神经干细胞向多巴胺神经元的分化。

GFP-Nurr1基因修饰神经干细胞的建立及过表达Nurr1对神经干细胞向多巴胺神经元分化的影响

目的利用慢病毒载体建立GFP-Nurr1基因修饰的原代神经干细胞(NSCs)模型并观察Nurr1过表达后NSCs向多巴胺神经元的分化影响。方法利用基因重组构建pLenO-DCE-Nurr1慢病毒载体,用慢病毒转染第三代NSCs,转染72 h后荧光检测转染效果;设置空白对照组、空载体组及DCE-Nurr1组,分别用Western blot及PCR检测Nurr1的表达差异;并将转染后的NSCs分化培养7 d后分别用免疫细胞化学检测、Western blot及PCR检测酪氨酸羟化酶(TH)的表达。结果慢病毒转染NSCs 72 h后,转染率可达90%,与对照组相比DCE-Nurr1组高表达Nurr1。经慢病毒载体感染后的NSCs仍具备分化潜能,分化培养后发现DCE-Nurr1组分化的神经细胞中TH阳性细胞分化率90.60%,对照组为21.2%。结论慢病毒载体可高效转染NSCs过表达Nurr1;Nurr1基因过表达可以促进中脑腹侧来源NSCs向TH阳性多巴胺能神经元方向分化。

芹黄素抑制小胶质细胞活化作用研究

目的探讨芹黄素对小胶质细胞活化的抑制作用。方法原代培养SD大鼠小胶质细胞,实验随机分为空白对照组、脂多糖组(LPS组)、LPS+芹黄素(10μM)组、LPS+芹黄素(20μM)组、LPS+芹黄素(50μM)组。MTT法检测芹黄素对小胶质细胞活性的影响;ELISA法检测IL-1、IL-10等炎症相关因子以及BDNF、PDNF等神经营养因子的表达;RTPCR、western blot检测炎症相关基因i NOS转录以及表达水平。结果 MTT检测结果表明,芹黄素对小胶质细胞活性无明显抑制。LPS刺激后,芹黄素预处理组IL-1等炎症因子表达水平明显低于单独LPS组(P<0.05);而芹黄素预处理组IL-10的表达则高于单独LPS组(P<0.01);与此同时,BDNF、PDNF等神经营养因子的分泌也有相同趋势(P<0.05)。芹黄素预处理组i NOS表达和转录水平也低于单独LPS组(P<0.05)。结论芹黄素可抑制活化状态小胶质细胞炎症因子以及炎症相关蛋白的表达,并可同时促进与神经元分化成熟相关神经营养因子的分泌。

核受体相关蛋白1基因慢病毒载体的构建

目的构建使用绿色荧光蛋白(GFP)标记的核受体相关蛋白1 (nuclear receptor related 1 protein,Nurr1)慢病毒表达载体(DCE-Nurr1)并鉴定。方法使用引物设计软件Primier5设计基因Nurr1引物并采用聚合酶链反应(PCR)对其进行扩增,利用XbaI和Not I分别将基因Nurr1和载体pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP进行双酶切,利用T4链接酶将已酶切的基因Nurr1和已酶切的载体pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP连接起来,完成慢病毒表达载体的构建。结果通过PCR成功地扩增了Nurr1基因并连接到载体pCDHCMV-MCS-EF1-copGFP上,序列与GenBank登记的序列一致。结论成功构建DCE-Nurr1慢病毒表达载体,为进一步在体内或体外研究Nurr1基因功能及其对多巴胺神经元的保护作用提供了基础。

Nurr1基因修饰胚胎中脑神经干细胞移植治疗帕金森病

目的探讨移植Nurr1基因修饰胚胎中脑神经干细胞对帕金森大鼠的治疗效果。方法(1)建立SD大鼠帕金森病模型;(2)原代培养SD大鼠胚胎中脑神经干细胞,并于神经干细胞过表达Nurr1;(3)移植治疗分组:假手术组(A组),移植神经干细胞组(B组),移植Nurr1修饰神经干细胞组(C组);(4)在移植后3周、6周、9周和12周分别对各组大鼠进行行为学测试,观察各组症状改善情况;(5)移植12周后,分别检测各组中Nurr1、TH蛋白表达情况和Nurr1荧光情况。结果(1)原代培养大鼠胚胎中脑神经干细胞,并于神经干细胞成功过表达Nurr1基因。(2)免疫荧光、Western Blot证实过表达Nurr1可以促进神经干细胞向多巴胺能神经元转化(P<0.05)。(3)移植Nurr1修饰神经干细胞可以有效的改善帕金森大鼠的症状(P<0.05),Western Blot证实小胶质细胞可显著促进移植后的神经干细胞在分化为多巴胺能神经元(P<0.05)。(4)移植后Nurr1能促进神经干细胞向多巴胺能神经元转化,提高移植神经干细胞的存活,达到更好治疗效果。结论Nurr1基因可以促进神经干细胞向多巴胺能神经元转化;移植修饰Nurr1神经干细胞可以有效治疗帕金森大鼠。

颈椎管内外节细胞神经瘤一例报道及文献复习

节细胞神经瘤是一种较为罕见、起源于交感神经节细胞的良性肿瘤,也称为神经节细胞瘤。青少年多见,好发于后纵膈、腹膜后和肾上腺,只有不到10%的病例累及椎管,而发生在颈段椎管内外的节细胞神经瘤则更为罕见[1-5]。脊柱节细胞神经瘤向椎旁生长,经椎间孔向椎管内延伸,因受到椎间孔的限制,常形成"哑铃"形病灶。早期无典型的临床症状,影像学表现也无明显特异性,常被误诊为神经鞘瘤等其他性质的椎管内外肿瘤。2021年6月同济大学附属上海市第四人民医院神经外科收治1例颈段椎管内外节细胞神经瘤患者,术前考虑为"神经鞘瘤",经显微外科手术全切肿瘤,术后病理证实为节细胞神经瘤。现结合国内外相关文献,就其临床表现、诊断及治疗方法报道如下。

小胶质细胞与神经干细胞共同培养对神经干细胞向多巴胺能神经元分化的影响

目的 探讨小胶质细胞与神经干细胞（NSCs）共同培养条件下对NSCs向多巴胺能神经元分化的促进作用。方法 （1）原代培养新生SD大鼠的小胶质细胞并鉴定。原代培养孕14 d SD大鼠胚胎NSCs并鉴定。（2）取鉴定后细胞分为NSCs单独培养组和小胶质细胞与NSCs共同培养组。2组细胞培养6 d后，采用细胞免疫荧光法及Western blotting实验检测多巴胺能神经元分化与成熟相关因子酪氨酸羟化酶（TH）、多巴胺转运体（DAT）及炎症因子3（Pitx3）蛋白的表达，采用PCR技术检测2组细胞TH、DAT以Pitx3基因转录水平的差异。结果 （1）新生SD大鼠小胶质细胞CD11b/c染色阳性，所得到的小胶质细胞纯度〉95%。孕14 d SD大鼠NSCs巢蛋白染色阳性。（2）细胞免疫荧光染色结果显示：与单独培养组比较，共同培养组NSCs TH、DAT及Pitx3阳性蛋白明显增多。Western blotting实验结果显示：共同培养组细胞TH、DAT以及Pitx3蛋白的表达量明显高于单独培养组，差异有统计学意义（P〈0.05）。（3）PCR实验结果显示：共同培养组TH、DAT以及Pitx3基因转录水平均明显高于单独培养组，差异有统计学意义（P〈0.05）。结论 小胶质细胞与NSCs共同培养可促进NSCs向多巴胺能神经元分化。

垂体腺瘤发生急性出血性卒中的影响因素分析

目的探讨垂体腺瘤发生急性出血性卒中的影响因素。方法回顾性分析2015年1月至2017年12月昆明医科大学第一附属医院神经外科手术治疗的319例垂体腺瘤患者的临床资料。根据是否发生垂体腺瘤急性出血性卒中分为卒中组(60例)和非卒中组(259例)。采用单因素和多因素logistic回归分析法判断年龄、性别、高血压病史、糖尿病史、肿瘤直径、肿瘤类型及复发性肿瘤等因素是否为垂体腺瘤发生急性出血性卒中的影响因素。绘制受试者工作特征(ROC)曲线并计算曲线下面积(AUC),寻找预测垂体腺瘤卒中的危险因素的最佳临界值。结果单因素分析结果显示,两组间性别、年龄、糖尿病史、肿瘤类型的差异均无统计学意义(均P>0.05);而高血压病史、肿瘤直径以及复发性肿瘤在两组之间的差异均有统计学意义(均P<0.05)。多因素logistic回归分析结果显示,高血压病史(OR=2.270,95%CI:1.090~4.728,P=0.029)、肿瘤直径(OR=1.087,95%CI:1.048~1.126,P<0.001)及复发性肿瘤(OR=3.266,95%CI:1.343~7.944,P=0.009)均为垂体腺瘤发生急性出血性卒中的独立危险因素。肿瘤直径预测垂体腺瘤发生急性出血性卒中的ROC曲线显示,AUC=0.718(95%CI:0.658~0.779,P<0.001),最佳临界值为24.5 mm,灵敏度为85%,特异度为45.6%。肿瘤直径≤25 mm者167例,其中垂体腺瘤卒中者16例,非卒中者151例;肿瘤直径>25 mm者152例,其中垂体腺瘤卒中者44例,非卒中者108例。肿瘤直径>25 mm是垂体腺瘤发生急性出血性卒中的危险因素(OR=3.845,95%CI:2.062~7.170,P<0.001)。结论有高血压病史、肿瘤直径>25 mm以及复发性的垂体腺瘤患者易发生垂体腺瘤急性出血性卒中。