草鱼呼肠孤病毒VP7基因核酸疫苗的构建及免疫效果

将草鱼呼肠孤病毒(GCRV)外衣壳蛋白VP7双基因(约0.9 kb)及团头鲂的β-肌动蛋白启动子(约0.56 kp)经扩增并鉴定正确后,克隆至基因转移载体pFastBacTM Dual中,获得重组质粒pFastBac-β-VP71-VP72,以此研究草鱼免疫实验及免疫效果。重组质粒按10、30、60μg分为3组,同时设30μg空载体组及对照组。于免疫后第14、21、28、49天通过RT-PCR检测VP7的转录水平、间接凝集反应测定抗体水平及攻毒试验检测免疫保护效果。结果显示,pFastBac-β-VP71-VP72导入鱼体后,VP7基因在β-肌动蛋白启动子的驱动下持续表达,至第49天仍能检测到目的基因的转录;各免疫组均有抗体产生,抗体效价在免疫后第21天达到最高,攻毒后10、30、60μg核酸疫苗免疫组死亡率分别为0%、0%、5%,而空载体组和对照组分别为30%和100%,表明pFastBac-β-VP71-VP72作为核酸疫苗对草鱼病毒性出血病有较好的免疫保护效果。研究结果为草鱼呼肠孤病毒核酸疫苗的研发与生产应用奠定了基础。

草鱼呼肠孤病毒外衣壳蛋白VP7重组疫苗的构建及其免疫效力评价

为探明呼肠孤病毒(GCRV)外衣壳蛋白VP7基因工程亚单位疫苗产生的抗体效价水平和免疫保护力,用RT-PCR方法,从GCRV中扩增到VP7基因片段,并克隆至原核表达载体pET-28a(+)中,得到重组质粒pET-VP7,酶切鉴定后,将pET-VP7转化到大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达,产生的重组蛋白经变性和复性后,按0.5、1.0、2.0 mg/尾的注射剂量分为3个免疫组,以等体积的氢氧化铝为佐剂进行注射。经SDS-PAGE电泳分析,发现了相对分子质量为34 000的蛋白表达带;Western Blot检测结果显示表达的蛋白具有很好的抗原性;间接凝集试验结果表明,3个免疫组均有抗体产生;攻毒试验结果表明,0.5、1.0、2.0 mg/尾重组蛋白剂量组的保护率分别为90%、85%、90%,对照组为0,表明所构建的疫苗具有较好的免疫作用。

脂质体对草鱼出血病核酸疫苗免疫效果的影响

将已构建完成的草鱼出血病核酸疫苗pFastBac-β-VP71-VP72以30μg的剂量,经Lipotap脂质体包裹后,背部肌肉注射草鱼体内,定期通过RT-PCR测定目的基因转录水平、间接凝集反应测定抗体水平,并通过与相应的重组质粒组、空载体组和对照组进行比较,来评价脂质体对核酸疫苗免疫保护效果的影响。结果显示,脂质体组至第70天仍能检测到目的基因的转录,且抗体效价明显高于其他各组,说明脂质体可显著增强该核酸疫苗的免疫活性,可作为一种有应用前景的核酸疫苗佐剂。

草鱼出血病病毒VP6蛋白的原核表达、纯化及免疫效果

为了探讨草鱼出血病病毒(GCRV)VP6亚单位疫苗对草鱼出血病的免疫保护作用,将vp6基因克隆进原核表达载体pET-28a(+),构建了重组质粒pET28a(+)-VP6。SDS-PAGE和Western-blotting显示,重组VP6蛋白的分子量约为43 ku,主要以包涵体形式存在,重组蛋白占菌体总蛋白的20%左右;Ni2+柱纯化后的重组蛋白,以每尾500μg肌肉注射免疫草鱼(14～20 cm,60～120 g),并在第14、21、28、49、70天通过间接凝集反应检测抗体水平,结果显示,免疫注射后第14天可检测到鱼体产生的特异性抗体,第21天达到最高峰,第70天仍可检测到抗体的存在;免疫注射第21天人工接种GCRV,免疫后的草鱼对出血病的保护力达100%。

草鱼出血病病毒vp6核酸疫苗的免疫效果评估

为了评估草鱼出血病病毒(GCRV)vp6基因核酸疫苗的免疫效果,将vp6基因克隆进pFastBacTMDual载体杆状病毒的多角体蛋白(Ph)启动子下游,同时将团头鲂(Megalobrama amblycephala)β-actin启动子控制的vp6基因克隆进杆状病毒的P10启动子下游,获核酸疫苗载体pFastBac-FA-VP6-ph-VP6。按每尾分别注射疫苗载体10、30、60μg的剂量免疫草鱼(Ctenopharyngodon idellus)(体长14～20 cm,体质量60～120 g),同设pFastBacTMDual载体(30μg/尾)阴性对照组及空白对照组(0.4 mL/尾无菌水)。于免疫后不同时间通过RT-PCR检测免疫鱼体中vp6基因的表达,并于免疫后第14、21、28、49、70天分别通过间接凝集反应检测血液中的抗体水平,并在免疫第21天感染GCRV评估免疫保护效果。结果显示,核酸疫苗免疫草鱼后,各免疫组均有抗体产生,抗体效价在免疫后第28天达到最高;攻毒后每尾注射疫苗载体10、30、60μg组的死亡率分别为0%、0%、5%,pFastBacTMDual载体对照组和空白对照组分别为30%和100%。表明构建的核酸疫苗对草鱼病毒性出血病有较好的免疫保护效果。

草鱼出血病基因疫苗的免疫效果

为探讨含有草鱼呼肠孤病毒外衣壳蛋白VP6基因的重组基因疫苗对草鱼出血病的免疫效果,将重组基因疫苗分别配制为10、30和60μg三个梯度,同时设30μg pFastBacTMDual空载体组,均以等体积的氢氧化铝佐剂为免疫增强剂,对草鱼进行注射,以未经处理的草鱼作为对照组。定期采血测定抗体效价,最后对各组草鱼进行攻毒试验并计算死亡率和免疫保护力。结果显示:注射疫苗的三组草鱼均产生抗体,10μg组效价为1∶6～1∶11;30μg组为1∶9～1∶13;60μg组为1∶11～1∶17,且各组效价均在第28天测定最高,免疫保护率依次为100%、100%和95%,而空载体组和对照组为70%和0%。研究表明,疫苗能够诱导草鱼产生免疫反应,为草鱼出血病核酸疫苗的生产应用和产业化提供了重要的理论依据。

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主要介绍通过优化炼钢生产工艺,使产品满足新的技术要求:S≤0.010％,P≤0.015％.[H]≤0.0002％,[O]≤0.0045％,[N]≤0.0055％。

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