EDAG-1在白血病和淋巴瘤细胞株中的表达

背景与目的:EDAG-1(embryonicdevelopassociatedgene1,EDAG-1)定位于9q22,在造血细胞特异表达,并与造血调控关系密切。本研究通过检测EDAG-1在白血病细胞和淋巴瘤细胞中的表达和编码区基因结构,探讨EDAG-1与白血病和淋巴瘤发病的关系。方法:选用白血病或淋巴瘤细胞株共15种,采用RT-PCR法检测表达EDAG-1基因的细胞株,并回收该基因cDNA编码区片段,构建相应的重组质粒并测序分析编码区突变情况。通过Northernblot和Westernblot分别确证EDAG-1mRNA和蛋白在白血病和淋巴瘤细胞株中的表达情况,利用Southernblot检测EDAG-1在白血病细胞和淋巴瘤细胞株中基因重排和扩增情况。结果:红系(K-562、HEL)、巨核系(DAMI、MEG-01)、Jurkat细胞在mRNA、蛋白水平均高表达EDAG-1,但其编码区结构未发现异常,也没有EDAG-1基因组的扩增和重排。发现HL-60细胞缺失EDAG-1,HuT78细胞EDAG-1发生重排。结论:EDAG-1可能与红系、巨核系白血病的发病机制有关,该基因激活的机制可能与编码区突变无关。

miR-142-3p靶向调控mll-af4融合基因的实验研究

本研究探讨mll-af4融合基因的表观遗传学调控机制,以筛选靶向调控mll-af4融合基因的microRNA。利用Targetscan在线分析软件预测特异性靶向mllaf4基因3′端非翻译区域(3′-untranslated region,3′UTR)的microRNA,采用PCR方法从1例健康供者DNA中扩增mll-af4基因3′UTR序列,插入经EcoRI和PstI双酶切的荧光素酶报告载体pGL3-M,采用脂质体SuperFect包裹荧光素酶重组质粒及microRNA表达质粒转染293T细胞,应用双荧光素酶检测试剂盒测定荧光素酶活性。miR-142-3p mimics以脂质体Hiperfect转染至RS4;11细胞,选用实时定量PCR及Western blot检测mll-af4 mRNA及蛋白的表达。结果表明,成功构建了含有1935bp、2104bp和1371bp的mll-af4基因3′UTR序列的荧光素酶报告重组质粒pGL3-AF4-3′UTR,并通过酶切及基因测序方法鉴定得到证实。荧光素酶报告实验提示,miR-142组荧光素酶活性明显低于对照组。RS4;11细胞中过表达miR-142-3p可以明显下调MLL-AF4融合蛋白及mRNA表达。结论:miR-142-3p通过靶向结合mll-af4基因3′UTR的结合位点特异调控mll-af4基因表达。

EDAG-1在人髓系白血病细胞株中的表达

目的 研究EDAG 1在人髓系白血病细胞株中的表达情况。方法 选取 4种人髓系白血病细胞株分别通过NorthernBlot、PCR、WesternBlot、SouthernBlot了解EDAG 1基因在mRNA、蛋白以及其基因组结构表达情况 ;通过凝胶阻滞实验分析选用白血病细胞系NF κBDNA结合活性。结果 发现向红系分化的K 5 6 2、HEL在mRNA、蛋白水平均高表达EDAG 1基因 ,但未发现突变、扩增和重排。HL 6 0细胞缺失EDAG 1基因。 4种白血病细胞株NF κBDNA结合活性是增强的 ,以高表达EDAG 1基因的细胞株明显。结论 红系白血病细胞株高表达EDAG 1基因 ,该基因的激活可能与编码区结构无关。

干细胞样U87胶质瘤细胞向内皮细胞转分化及VEGFR2人源化单克隆抗体的干预作用

目的建立干细胞样U87胶质瘤细胞向内皮细胞的转分化模型,初步评价抗VEGFR2人源化单克隆抗体对转分化的影响。方法体外诱导培养获得干细胞样U87胶质瘤细胞;流式细胞仪检测CD133+细胞含量;定量PCR检测CD133、Nestin以及VEGFR2表达;观察干细胞样U87细胞的致瘤能力、肿瘤生长速度和CD31表达情况;观察干细胞样U87细胞在Matrigel上血管状结构形成和CD31、CD34、vW F表达情况;建立干细胞样U87细胞向内皮细胞的转分化模型,评价抗VEGFR2人源单抗对转分化的抑制作用。结果获得干细胞球样的U87细胞,其肿瘤生长更快,且血管增多,接种在Matrigel上形成血管状结构,CD31、CD34、vW F表达增加;抗VEGFR2人源单抗使血管状结构和CD31、CD34、vW F表达均减少。结论成功建立干细胞样U8细胞向内皮细胞转分化模型,VEGFR2人源化单抗对转分化有抑制作用。

化合物2G2抑制K562细胞增殖并诱导凋亡

目的建立基于白血病细胞K562生长活力的小分子化合物筛选的高通量筛选模型,筛选特异性针对慢性粒细胞白血病(CML)增殖抑制的先导化合物。方法以K562细胞系为实验对象,在96孔板上,利用MTS/PMS比色实验测定化合物对细胞活力的影响,建立具有抑制K562细胞活性的化合物筛选模型,并应用该模型完成了1000多种小分子化合物的筛选,对筛选得到的活性化合物通过3H-TdR掺入实验、细胞生长曲线、细胞周期和凋亡检测等实验进行验证和分析。结果建立并利用96孔板药物筛选模型,筛选获得一个具有一定特异性抑制K562细胞增殖的化合物——2G2。结论成功建立了抗白血病药物的筛选方法,为白血病治疗药物的开发研究提供了新的筛选模型。

小动物活体成像法评价硝呋替莫对人源性神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y肾转移瘤模型裸鼠的治疗作用

目的评价硝呋替莫(nifurtimox)对人源性神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y裸鼠肾转移瘤的治疗作用。方法采用MTT法测定硝呋替莫对SH-SY5Y细胞增殖的抑制作用;使用由本实验室构建的稳定表达萤火虫荧光素酶(luc2)和绿色荧光蛋白(GFP)的SH-SY5Y细胞,荧光显微镜下观察硝呋替莫对SH-SY5Y(luc2/GFP)细胞的生长抑制;建立荷SH-SY5Y细胞的nu/nu裸鼠肾转移瘤动物模型,使用IVIS Spectrum CT成像系统体外检测活细胞与发光强度的相关性,并监测动物模型体内肿瘤生长状况,主要依据发光强度评价该药体内抗肿瘤效果。结果 MTT结果显示,硝呋替莫可明显抑制SH-SY5Y(luc2/GFP)细胞增殖,IC_(50)值为(25.88±1.48)～(26.74±1.27)mg/L;荧光显微镜下也同样观测到硝呋替莫显著抑制SH-SY5Y(luc2/GFP)细胞的生长;IVIS Spectrum CT检测体外细胞显示,活细胞数与发光强度呈正相关(R^2=0.99749);体内实验表明,该药能显著延缓肾转移瘤SH-SY5Y(luc2/GFP)模型裸鼠的疾病进展、缓解其体质恶化,其对裸鼠生物发光强度抑制率和荷瘤鼠的抑瘤率呈现明显的剂量效应关系,最大抑制率分别为86.4%和71.8%。与阳性药替莫唑胺治疗组相比,硝呋替莫各治疗组的综合治疗优势更为显著。结论通过体内外实验结果的综合分析,证实硝呋替莫对SH-SY5Y(luc2/GFP)肾转移瘤模型裸鼠具有良好的治疗作用。

核磷蛋白与肿瘤的发生

核磷蛋白(nucleophosmin,NPM)是一个具有多种功能的重要蛋白,定位于核仁,可在胞核与胞浆之间快速穿梭。NPM基因在多种人类肿瘤中过表达,因此被公认为肿瘤标志物和癌基因。后来研究发现NPM也具有抑制肿瘤的功能,它的缺失、突变甚至重排与多种肿瘤的发生密切相关。这表明NPM的作用及其机制非常复杂,可能通过多种机制调控肿瘤的发生。

真核细胞诱导表达系统研究进展

在体内外表达外源基因是研究基因功能的一种重要手段。常规表达系统可实现基因的组成型表达,但却不能调控基因的表达时间和表达水平。用常规表达系统研究那些对细胞有毒性作用的基因或在特定组织或特定发育阶段表达的基因,存在一定的局限性。诱导表达系统可以在特定时间以适当的水平表达目的蛋白,这有利于基因功能的研究。目前已经建立了几种较理想的诱导表达系统,它们是研究新基因功能、构建人类疾病动物模型、寻找新的有效药物的有力工具。本文总结了目前常用的几种真核细胞诱导表达系统及其特点。

红系分化相关基因相互作用蛋白质的分离与鉴定

目的制备红系分化相关基因(erythroid differentiation-associated gene,EDAG)蛋白的单克隆抗体,利用免疫沉淀联合质谱技术对EDAG相互作用蛋白质进行分离与鉴定。方法构建EDAG原核表达载体,通过诱导、表达、纯化获得EDAG融合蛋白,杂交瘤技术建立分泌EDAG单克隆抗体的杂交瘤细胞株,利用Western印迹筛选阳性杂交瘤细胞,免疫小鼠得腹水,最后用免疫共沉淀与质谱联合鉴定EDAG相互作用蛋白。结果纯化获得EDAG重组蛋白,筛选出4株分泌EDAG单克隆抗体的杂交瘤细胞株,并制备了腹水。该抗体均可用于内源EDAG蛋白的检测,其中两种抗体可用于免疫共沉淀实验,运用质谱技术筛选获得EDAG候选相互作用蛋白。结论利用EDAG单克隆抗体,筛选到EDAG候选相互作用蛋白质13种,涉及细胞增殖及转录等过程,为EDAG的功能研究及其分子机制的阐明提供了新的线索。