重组病毒法捕获宫颈癌循环肿瘤细胞的初步研究

目的构建新的含有表达绿色荧光蛋白(GFP)的单纯疱疹病毒(OHSV2-GFP),初步验证其对循环肿瘤细胞特异性示踪作用。方法采用PCR、分子克隆及同源重组技术,从HG52野生病毒株的基因组中剔除ICP34.5基因并插入GFP表达序列,构建OHSV2-GFP。抽取健康志愿者外周血4mL,将Hela细胞按10、100、500个加入外周血中后,按照MOI=1比例转染重组病毒OHSV2-GFP^+,然后用流式细胞仪进行该方法检出率测定;收集40例正常人、15例宫颈炎患者和20例宫颈癌患者外周血4mL,裂解去除红细胞后,按照MOI=1的比例转染重组病毒OHSV2-GFP^+,24h后收集细胞,流式细胞仪检测CD45^+/GFP^-细胞并计数,初步检测该方法临床应用的可行性。结果将Hela细胞按10、100、500个加入外周血中后,检测结果显示,检出数分别为6.3、61.7、300.5,总体检出率为61.7%,线性回归分析显示应用此方法捕获的CTC数量与预先加的肿瘤细胞数呈线性关系,R^2≥0.95。宫颈癌患者的GFP^+/CD45^-细胞数(10.90±2.3)个明显高于正常人(0.38±0.12)和宫颈炎患者(0.33±0.09)个,差异具有显著性(P<0.01)。结论本研究应用循环肿瘤细胞能够被该重组病毒捕获的特性,建立一种新的CTCs检测技术,并针对此技术的可靠性进行了证实,为进一步的临床应用研究打下了基础。

重组Ⅱ型单纯疱疹病毒(OH2)基因组修饰稳定性研究

目的探讨重组Ⅱ型单纯疱疹病毒(OH2)基因组修饰的稳定性。方法型别鉴定实验根据Ⅰ型(HSV-1)及Ⅱ型(HSV-2)单纯疱疹病毒g D糖蛋白基因的保守序列设计引物进行PCR扩增,HSV-1 PCR片段上有一个Msp I酶切位点,经酶切及电泳实验鉴别OH2病毒的型别;基因修饰实验根据被敲除或插入的序列位点上下游病毒核酸序列设计引物进行PCR扩增及电泳,并用电泳图分析OH2病毒基因组中是否剔除ICP34.5基因、ICP47基因及插入hGM-CSF基因;ELISA检测OH2上清中hGM-CSF含量验证插入的hGM-CSF基因能否正常表达。结果型别鉴定实验中HSV-1经酶切实验出现130bp和70bp两条条带,而HSV-2和OH2病毒PCR条带和酶切条带均只有一条,且为200bp。基因修饰实验中OH2病毒在四对引物下扩增,能扩增出对应大小的条带。ELISA实验中hGM-CSF浓度在31.25~500pg/m L范围内线性关系良好,且OH2病毒中hGM-CSF表达量均大于2ng/mL。结论 OH2病毒中被修饰的基因稳定地存在,同时插入的hGM-CSF基因能够正常表达。