乙酰紫堇灵通过抑制肠上皮细胞凋亡改善三硝基苯磺酸诱导的小鼠克罗恩病样结肠炎

目的探究乙酰紫堇灵(Ace)对2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)诱导的小鼠克罗恩病(CD)样结肠炎的作用及机制。方法将40只雄性C57BL/6小鼠随机分为5组:WT组、TNBS组和Ace干预组(Ace-10组、Ace-20组和Ace-40组),每组8只。TNBS组和Ace干预组小鼠均采用TNBS诱导建立结肠炎模型,Ace干预组分别给予10、20、40 mg/kg的Ace灌胃治疗,而TNBS组均给予等量生理盐水。通过监测体质量变化、疾病活动评分(DAI)、结肠长度测量、HE染色和组织学评分评估Ace对TNBS结肠炎小鼠的保护作用。小鼠结肠组织经免疫荧光检测Claudin-1、Western blot检测紧密连接蛋白(Claudin-1和ZO-1)和凋亡相关蛋白(C-caspase3、Bax和Bcl-2)以及Tunel染色检测肠上皮细胞凋亡的数量。采用结肠类器官经脂多糖诱导建立凋亡模型,分为Control组、脂多糖组及Ace组,采用免疫荧光检测Claudin-1以及Western blot检测Claudin-1、ZO-1、C-caspase3、Bax和Bcl-2的表达。利用网络药理学预测Ace抑制肠上皮细胞凋亡的分子机制可能与PI3K-AKT通路相关,采用Western blot验证小鼠结肠组织和结肠类器官中pPI3K和p-AKT的表达。体外凋亡模型中加入PI3K-AKT信号通路激活剂(740Y-P),Western blot验证结肠类器官中p-PI3K、pAKT、C-caspase3、Bax及Bcl-2的表达。结果与TNBS组相比,Ace治疗可显著缓解TNBS小鼠的体质量下降、结肠长度缩短、DAI评分和炎症评分升高(P<0.05)。在Ace组小鼠结肠组织中,免疫荧光结果显示:Claudin-1的表达上调(P<0.05);Western blot结果显示:Claudin-1、ZO-1和Bcl-2的蛋白水平升高,而C-caspase3和Bax的表达降低(P<0.05);Tunel染色结果显示:肠上皮细胞凋亡数量减少(P<0.05)。在体外凋亡模型中,经Ace干预后,免疫荧光和Western blot结果显示,结肠类器官组织中ZO-1和Claudin-1的表达升高(P<0.05)、C-caspase3和Bax表达降低,而Bcl-2表达升高(P<0.05)。KEGG通路富集预测发现PI3K-AKT信号通路与Ace治疗CD具有相关性,且Western blot结果表明,在体内外模型中经Ace干预后p-AKT和p-PI3K的表达显著降低(P<0.05)。另外,PI3K-AKT激活剂(740Y-P)促进p-PI3K、p-AKT、C-caspase3和Bax的表达,而抑制Bcl-2的表达(P<0.05)。结论Ace可能通过干扰PI3K/AKT信号的激活抑制肠上皮细胞凋亡,进而发挥对TNBS诱导的小鼠CD样结肠炎的保护作用。