基于Bt毒素的杀虫蛋白理性设计与创新应用策略

Bt毒素是源于苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)的具有特殊杀虫功能的大分子蛋白,其制剂和转基因作物已广泛用于害虫防治,产生了巨大的经济和社会生态效益。围绕Bt毒素挖掘和提升其应用价值是持续研究的热点,特别是随着Bt毒素结构功能和作用机制日趋明晰,为其功能修饰和创新应用创造了条件,相关研究蓬勃发展,成效显著。大量研究表明,采用定点突变、结构域替换或融合以及抗独特型抗体模拟等策略,是理性设计活性更高、稳定性更强、杀虫谱更广、非靶标生物安全性更高甚至是可用于害虫抗药性治理的有别于母体Bt毒素的突变体、结构杂合体乃至功能效应物抗体等新型杀虫蛋白的有效手段;此外,采用催化毒素活化、驱动毒素靶向受体结合、促进毒素表达以及同源或异源杀虫材料复配或共表达的协同促效等创新增效策略,也是助推Bt毒素应用价值的重要手段。本文总结了Bt毒素结构功能和作用机制,梳理了基于Bt毒素功能修饰的突变体、结构杂合体以及功能效应物抗体等新型杀虫蛋白理性设计和基于Bt毒素功能增效的创新应用策略等相关研究进展,并结合作者团队在模拟Bt毒素杀虫功能效应物抗体靶向设计研发方面的最新成果,探讨了基于Bt毒素的杀虫蛋白理性设计与创新应用策略未来发展动向及潜在可行捷径,为相关研究提供较为全面的最新有价值的文献资料和启发思路。

苏云金芽孢杆菌Cry毒素共性结构短肽串联表达及功能分析

苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)Cry毒素是一类具有抗虫功能的微生物蛋白。将前期基于Bt Cry毒素家族氨基酸序列及结构信息设计获得的呈现Cry毒素共性结构的3个短肽,拼接成为具有免疫原性的长链多肽(Bt Cry-GXJG-11),以期研发Bt Cry毒素杀虫功能的模拟物及制备Bt Cry毒素检测用广谱抗体的免疫原。分子建模预测结果显示,Bt Cry-GXJG-11与Bt Cry毒素靶标害虫棉铃虫(Helicoverpa armigera)钙黏蛋白受体(HaCad-TBR)存在互作效应,并初步明确了两者互作的关键氨基酸位点为244TYR。经原核表达,获得了质量浓度为0.5 mg/mL的Bt Cry-GXJG-11纯蛋白,测得其与HaCad-TBR的亲和力常数(KD)为2.151×10^(-7)mol/L。室内生测试验表明,Bt Cry-GXJG-11对棉铃虫具有一定杀虫活性,校正死亡率为27.5%;且以其免疫的小鼠血清能同时识别6种Bt Cry毒素(Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1Ah、Cry1B、Cry1C、Cry1F)。

农药联合复配在农作物病虫害防治上的研究进展

病虫害严重威胁了农作物生长发育及农产品质量安全。农药是病虫害防治的关键,但长期滥用不仅加速了病虫害的抗药性,也给生态环境造成极大污染,合理用药是农业可持续发展的必然要求。农药联合复配是提升现有农药对靶标病虫害防治效率的最直接方式,同时通过复配可以减少药用量,也能提高农产品质量安全水平、延缓病虫害抗药性以及减少环境污染。农药联合复配是农药合理优化利用研究的热点。本文按化学-化学农药复配、生物-生物农药复配和生物-化学农药复配3种常规形式进行汇总归类,系统梳理近年国内外有关这3种形式的农药联合复配在常见农作物病虫害防治上的研究状况及典型应用实例;并就复配形式及其应用前景进行展望,特别对农药联合复配未来如何迈向更高效、更安全、更绿色的发展道路以及在探索过程中潜在的技术瓶颈等问题进行探讨、提出应对策略,同时也对农药复配在应用过程中所暴露的可能叠加危害生态环境和非靶标生物等问题表达关注;旨在为推进农药创新利用提供最新参考资料和潜在启发思路。

具杀虫功能的蛋白类生物材料研究进展

害虫是威胁农作物生长发育及产品品质的主要风险因素,对其有效防治是保障农作物稳定生产的重要环节。传统依赖化学农药对害虫防治效果显著,但化学农药本身对非靶标生物以及生态环境所造成的持久性危害风险也同样突出。害虫绿色防治是农业可持续发展的必然要求,其中具杀虫功能的蛋白类生物材料因兼具安全性高、可量产药剂及可在转基因抗虫作物应用的多重优势,是害虫绿色防治创新研发和应用的热点。如具备杀虫功能的Bt毒素、凝集素、动物毒素、防御素、蛋白酶抑制剂等蛋白类生物材料在害虫防治上已有深入研究和广泛应用;此外,近年来包括杀虫抗体在内的一些新型杀虫蛋白和相应创新技术也不断涌现,发展极为迅猛。基于此,本文在系统梳理当前成熟的具杀虫功能的蛋白类生物材料研发和应用现状的基础上,结合作者团队在杀虫抗体靶向设计上取得的原创性研究成果和经验,对蛋白类生物杀虫材料潜在的创新研发与应用进行展望,旨在为农业害虫绿色防治研究提供最新文献资料和技术参考。

食源性致病微生物危害风险及其防控用抗菌生物活性肽研究进展

食源致病微生物是污染食品、食用农产品的主要生物危害物,严重威胁人类及动物健康;同时也给食品、食用农产品产业造成巨大经济损失,是制约产业健康可持续发展的关键危害因素。传统依赖抗生素对致病微生物的防控效果显著,但由于抗生素长期的不合理使用甚至是滥用所诱发产生的致病微生物耐药性,以及对人类和动物体内脏器、肠道组织、神经和代谢系统正常功能构成的潜在危害性等问题也同样突出。抗菌生物活性肽作为具有抗菌功能的生物多肽类蛋白质,被认为是对人类、动物以及生态环境友好的抗菌物质,有望替代抗生素用于致病微生物的防控,现已成为探索新型安全抗菌类药物研发的热点。全面梳理了食源致病微生物种类、污染特点及其主要危害风险;系统概述了抗菌生物活性肽主要类型、来源及其创制技术;着重介绍了当前抗菌生物活性肽在食源致病微生物防控上的研究状况,并深入探讨了其应用前景、存在问题及拟解决对策,旨在为食品、食用农产品中食源性致病微生物筛查以及靶向防控技术提供最新的有参考价值的文献资料和创新思路。

农药危害风险及其残留检测用广谱特异性抗体研究进展

农药残留是威胁农产品质量安全的关键危害因素之一,是农产品质量安全监管工作的重要对象。当前已被开发和投入使用的农药种类纷繁复杂,农药残留检测工作任务多、责任大,因此建立一套可用于农药残留检测用的免疫学快速检测方法一直是广大科研工作者努力探索的目标。本文分门别类梳理农产品中主要农药残留及其危害,探讨国内外抗体创制领域最新热点技术,并就农药残留检测用广谱特异性抗体研发和应用现状进行概述及展望,旨在为指导农药残留快速检测技术的研发提供参考。

间接竞争时间分辨荧光免疫分析法检测稻米中Cry1C毒素

利用免疫新西兰大白兔制备Cry1C毒素多克隆抗体,建立间接竞争时间分辨荧光免疫分析（CI-TRFIA）方法,用于稻米中Cry1C毒素的残留检测。通过4次免疫,采集Cry1C毒素多克隆抗体血清,并用饱和硫酸铵沉淀和Protein A柱纯化,测定抗体效价;以制备Eu-N1标记的羊抗兔IgG作为检测抗体,建立Cry1C毒素的CI-TRFIA检测方法,并进行抗原类似物的特异性分析和Cry1C毒素在稻米中的添加回收试验。结果表明：获得的多克隆抗体质量浓度为3.86 mg·mL^-1,效价为1∶48 000;建立的CI-TRFIA检测方法,其灵敏度（IC10）为0.074 ng·mL^-1,中抑制浓度（IC50）为60.16 ng·mL^-1,线性检测范围（IC20~IC80）为0.96~1 633.60 ng·mL^-1;对Cry1B、Cry1Ab和Cry1Ac均有一定的交叉反应;添加回收试验的批内、批间回收率为84.53%~107.12%,变异系数为6.05%~11.24%。结论：该检测方法稳定性和重复性较好,可以满足Cry1C毒素的检测要求。

人源化抗Cry1B毒素蛋白单链抗体的原核表达及生物学活性测定

利用含有重组噬菌粒的噬菌体直接侵染大肠杆菌(Escherichia coli)HB2151,原核分泌表达了抗苏云金芽孢杆菌(Ba-cillus thuringiensis,Bt)Cry1B毒素蛋白的单链抗体(single chain-variable fragment,scFv),经纯化、鉴定抗原结合活性后,建立了Cry1B毒素蛋白的ELISA检测方法。方法以展示scFv抗体的重组噬菌体感染E.coli HB2151,经PCR和基因测序检测克隆scFv基因片段的完整性,用SDS-PAGE方法检测scFv在E.coli HB2151宿主菌中的表达水平,用ELISA测定法检测scFv的抗原结合活性,通过时间梯度优化获得可溶性表达蛋白的最佳培养时间。结果表明:经PCR、DNA电泳及基因测序等,均证实重组噬菌体对E.coli HB2151宿主菌侵染成功,SDS-PAGE电泳结果表明scFv抗体表达成功,纯化后的蛋白质量浓度为132μg.mL-1。以纯化的scFv蛋白为基础建立了对Cry1B毒素蛋白的间接竞争ELISA法,方法的抑制中质量浓度(IC50)为1.398μg.mL-1,最低检测限(IC10)为0.025 7μg.mL-1,线性检测范围为0.5～5.0μg.mL-1,scFv对Cry1C的交叉反应率为7.51%;与Cry1Ab、Cry1Ac的交叉反应率均小于0.1%;在培养温度30℃,1 mmol.L-1IPTG诱导条件下,scFv在E.coliHB2151宿主中的最佳诱导表达时间为12 h。本研究成功地将抗Cry1B毒素蛋白的scFv在E.coli HB2151中进行了可溶性表达,获得了具有抗原结合活性的scFv融合型抗体,为实际生产应用与试剂盒研发提供了基础。

凝集素在农业和食品领域中的应用研究进展

凝集素是一类能与糖及糖类物质特异性非共价可逆结合的蛋白质或糖蛋白,广泛存在于动植物和微生物体内。部分凝集素具有抗虫、抗菌、抗病毒以及靶向识别特定微生物种类等功能,因而成为农业绿色防控和食品防腐保鲜及致病微生物筛查检测领域研究的热点。本文系统梳理了国内外有关凝集素在农业病虫害防控、农业生产调节、食源性致病微生物防控及筛查检测等方面的应用研究状况,并探讨了其在这些方面的应用前景、存在问题及解决问题的对策,旨在为农业绿色防控和食品防腐保鲜及农产品质量安全检测研究提供最新的文献资料和思路。

鼠源噬菌体抗体展示库的构建及初步应用

构建可用于特异性单链抗体(ScFv)筛选和应用的大容量鼠源噬菌体抗体展示库,获得拥有自主知识产权的抗体库材料。从小鼠脾脏细胞中提取总RNA,反转录成c DNA后,分别扩增抗体的重链基因、轻链基因,并设计2条互补的Linker基因。采用重叠延伸PCR(SOE-PCR)法将重链-Linker和Linker-轻链拼接为完整的ScFv基因,酶切、酶连后,将ScFv基因克隆到pCANTAB-5E噬菌粒载体上,经电穿孔导入E.coli TG1感受态细胞中,过夜培养获得初级噬菌体展示库。以单克隆菌落数计算库容量大小,通过比对随机挑取的单克隆噬菌体ScFv可变区序列的差异,分析库的多样性。以Bt毒素(Cry1B、Cry1C、Cry1F)为包被抗原,从库中筛选具有结合活性的ScFv验证库的实用性。经检测,提取的总RNA条带清晰,浓度为2.76μg/μl,扩增的抗体重链基因、轻链基因条带清晰,且2条互补的Linker基因成功添加到重链基因和轻链基因上。经SOE-PCR法扩增,重链-Linker与Linker-轻链成功拼接为ScFv基因。电转化后,经PCR(Polymerase chain reaction)扩增和凝胶电泳检测,证实ScFv基因克隆成功,测得初级噬菌体抗体展示库的库容为3.67×10~8。随机挑取12个单克隆菌种进行测序和比对,证实ScFv基因为鼠源抗体基因,且12个单克隆菌种的ScFv基因可变区均有一定差异,说明ScFv基因具有多样性。以3种Bt毒素(Cry1B、Cry1C、Cry1F)为抗原,经4轮特异性富集筛选后均获得了具有抗原结合活性的噬菌体ScFv菌种,表明该库的实用性较强。

食品中金黄色葡萄球菌检测及防控技术研究

金黄色葡萄球菌是威胁食品质量安全的重要生物污染物。本文在分析金黄色葡萄球菌主要生物危害风险的基础上,重点梳理了食品领域针对其检测和防控的研究现状,并结合最新研究成果,深入探讨了食品领域金黄色葡萄球菌检测和防控技术可能的创新思路。

抗独特型抗体在食用农产品危害物监控中的应用研究

食用农产品质量安全危害物来源广、种类多,从产地环境到农业投入品再到收储运环节,生物、化学污染物危害风险几乎伴随整个产供链。对危害物的高效监测,以及探索更为安全的危害物(特别是高毒投入品)替代功能效应物是食用农产品质量安全监控可持续发展的必然要求。基于“免疫网络学说”的抗独特型抗体,因具有模拟抗原表位构象乃至生物活性的特性,已被证实可以用于免疫原功能效应物创制,这为食用农产品质量安全危害物检测或功能替代材料研发提供了新思路。系统梳理了食用农产品产供过程中可能涉及的危害物及其安全风险;全面整理并介绍了抗独特型抗体技术及其在食用农产品质量安全危害物监控中的应用状况;结合作者及所在团队近年科研成果,探讨了抗独特型抗体在食用农产品质量安全危害物监控中的应用前景、存在问题以及拟解决对策。

靶向模拟Bt Cry1C蛋白抗虫功能的人源化基因工程抗体筛选及鉴定

Bt蛋白制剂及其转基因作物长时间推广应用,害虫抗药性等问题日益凸显,探索新型安全抗虫材料已成为竞先研究的热点。基于抗体免疫网络学说的抗独特型抗体技术被证实可用于研发抗原生物活性类似物,有望成为靶向创制模拟Bt蛋白抗虫功能材料的新途径。以Bt Cry1C蛋白多克隆抗体为包被抗原,从人源化噬菌体单链抗体库中获得9个阳性单克隆,其中E8-Anti-Id scFv经鉴定为β型抗独特型基因工程单链抗体。Bt Cry1C蛋白多克隆抗体、小菜蛾(Plutella xylostella)刷状缘膜囊泡(brush border membrane vesicles,BBMV)蛋白和稻纵卷叶螟(Cnaphalocrocis medinalis)BBMV蛋白对E8-Anti-Id scFv的竞争抑制中浓度(IC_(50))分别为2.625、3.638和4.605μg/mL。室内生物测定显示,噬菌体展示形式的E8-Anti-Id scFv在滴度为1.2×10^(8) CFU/mL浓度条件下,对供试的小菜蛾和稻纵卷叶螟在72 h内的校正死亡率为58.69%和52.82%,其抗虫活性分别达到浓度为20μg/mL的原Bt Cry1C蛋白的77.87%和73.21%。由此表明,获得的E8抗独特型基因工程单链抗体材料初步具备模拟Bt Cry1C蛋白抗虫功能的特性,为后期深入研究和推进应用奠定了技术和材料基础。

植物内生菌在食用农产品质量安全与营养品质调控中的研究进展

食用农产品是食品的基础原料,直接关乎人类日常生活和健康,对其质量安全和营养品质调控是农业和食品领域研究的重大课题。植物内生菌是健康植物体内的共生菌,菌体及其代谢产物能对调控植株生长发育以及环境胁迫适应等方面产生重要影响。目前对植物内生菌的研究已渗透到农业生产过程中的各个领域,其应用价值逐渐崭露头角,成为助推农业生产和提升农产品品质的潜在辅助手段,特别在食用农产品质量安全与营养品质调控上具有独特优势。本文就植物内生菌在食用农产品生产过程中产地环境危害物、农药投入品危害物、病虫害以及营养品质指标等调控方面的最新研究状况进行系统综述,并就植物内生菌在食用农产品质量安全与营养品质指标调控研究上的技术瓶颈以及未来可拓展的研究和应用展开探讨,为食用农产品质量安全与营养品质调控领域研究提供最新的有参考价值的文献资料和潜在技术创新思路。

抗苏云金芽孢杆菌Cry1B毒蛋白质单链抗体的筛选与鉴定

利用人源化噬菌体抗体库筛选抗Bt Cry1B毒蛋白质的单链抗体(Single-chain antibodies,scFv)。将扩增后的噬菌体抗体库与固相化包被的Cry1B毒蛋白质特异性结合,经4轮"吸附-洗脱-扩增"后,富集特异性识别Cry1B毒蛋白质的噬菌体单链抗体。从最后一轮筛选中随机挑取单菌落进行单克隆ELISA鉴定,对阳性克隆进行PCR扩增、DNA电泳鉴定及测序,成功筛选获得8个阳性噬菌体scFvs,经鉴定均有完整外源基因片段插入。挑取阳性值最高的scFv(1E2)建立了基于单链抗体的Cry1B毒蛋白质间接竞争ELISA检测方法。结果表明,Cry1B毒蛋白质对噬菌体scFv(1E2)的抑制中浓度(IC50)为1.075μg/ml,最低检测限(IC10)为0.013 4μg/ml,线性检测范围在0.5μg/ml至4.0μg/ml之间。

噬菌体展示抗体在我国食用农产品生物毒素检测中的应用研究

噬菌体展示抗体技术是近年来研究最热的新型人工基因工程抗体制备技术。本文系统梳理了食用农产品在产供过程中主要生物毒素危害物种类,以及噬菌体展示抗体在相应毒素检测上的应用状况;探讨了该新型抗体制备技术存在的不足,并初步提出了相应的可行性解决方案,旨在为我国食用农产品产供过程中生物毒素危害物检测用新型抗体的研发和利用提供较为详实的参考资料。

基因工程抗体在微囊藻毒素检测分析中的应用研究

微囊藻毒素是蓝藻水华过程中产生的一类小分子多肽生物毒素,能对人和动物的肝脏造成严重损伤,属于2B类致癌物质。由于全球性工业和生活废水的大量排放以及气候变暖等现实因素,蓝藻水华现象日趋频繁和加剧,使得微囊藻毒素在水体和土壤中大量蓄积,严重威胁生态环境和农产品质量安全。基于"抗体-抗原"识别原理的免疫学检测方法是当前生物毒素快速检测研究的热点,近年抗体创制技术突飞猛进,现已从传统的多克隆抗体和单克隆抗体逐渐发展到了新型的基因工程人工抗体创制阶段。该文系统阐述了微囊藻毒素产生的内外因素及其对生态系统、人和动物的主要危害风险;全面梳理了基因工程抗体创制技术及其在微囊藻毒素检测应用研究上的最新进展;并结合作者及所在科研团队最新研究成果,深入探讨了基因工程抗体在微囊藻毒素检测应用上的发展趋势、存在的问题以及拟解决的对策。

抗Cry1F毒素单链抗体的筛选及初步应用

对扩增的Tomlinson I噬菌体抗体库进行3轮特异性富集,挑取单菌落,采用ELISA、PCR及测序比对分析鉴定阳性噬菌体单链抗体(sc Fv);以宿主替换的方式将阳性噬菌体sc Fv基因导入Escherichia coli HB2151中进行可溶性表达,sc Fv过柱纯化后,建立针对Cry1 F毒素的IC-ELISA检测方法。以Cry1 B、Cry1 C、Cry1 Ab、Cry1 Ac作为竞争抑制物,分析sc Fv的特异性,以Cry1 F毒素在玉米中的添加回收试验评价检测方法的实用性。结果显示,从第3轮富集库中筛选到了11株具有Cry1F毒素结合活性的噬菌体sc Fv菌株,经PCR鉴定都含有目的条带,对其中2株(H1、G9)进行测序,证实为人源化的sc Fv。选取G9号阳性噬菌体sc Fv进行可溶性表达,纯化后收集到的sc Fv浓度为256μg/ml。建立的IC-ELISA检测方法检测灵敏度(IC10)为5.99 ng/ml,抑制中浓度(IC50)为0.410μg/ml,线性检测范围(IC20~IC80)为0.107~0.713μg/ml。sc Fv(G9)对Cry1B、Cry1C具有一定结合活性,交叉反应率分别达到了20.92%和15.59%,但不识别Cry1Ab和Cry1Ac,交叉反应率均低于0.1%。添加回收试验结果表明,基于sc Fv(G9)建立的IC-ELISA检测方法稳定性和重复性都比较好。

抗Bt(Cry1B)毒素单链抗体在sf9昆虫细胞中的表达及活性测定

通过构建pFastBacTM HT-A-scFv重组质粒,并将重组质粒化转DH10BacTM Escherichia coli感受态细胞,进行蓝白斑筛选,获得阳性克隆.PCR和基因测序检测证实挑取的白斑阳性单克隆存在完整、正确的单链抗体基因.提取阳性克隆中的重组杆状病毒穿梭载体（Bacmid-scFv）侵染sf9昆虫细胞,细胞发生明显病变特征.通过SDS-PAGE、Western blotting和间接竞争性ELISA等方法检测,发现单链抗体在sf9昆虫细胞中表达成功,测得纯化后蛋白浓度为103.000 0 μg/ml,Cry1B毒素对单链抗体的抑制中浓度（IC50）为1.010 0 μg/ml,最低检测线IC10为0.011 3μg/ml,线性检测范围为0.500 0～10.000 0 μg/ml.可溶性scFv对抗原类似物无交叉反应.

基于双抗夹心的Cry1B毒素蛋白质TRFIA检测方法的建立与评价

为了建立检测Cry1B毒素蛋白质的双抗夹心时间分辨荧光免疫分析(TRFIA)方法,利用稀土元素Eu3+作为示踪剂,以可溶性表达的抗Cry1B毒素蛋白质单链抗体(scFv)作为捕获抗体,以免疫兔血清获得的抗Cry1B毒素蛋白质多克隆抗体为检测抗体,建立检测Cry1B抗原的TRFIA技术,并对其进行方法学的综合评价。通过正交试验,获得的最佳单链抗体(Capture antibody)、多克隆抗体(Detection antibody)、Eu3+标记的二抗(Tracer antibody)浓度分别是2.500μg/ml、2.000μg/ml、1.000μg/ml。标准检测曲线灵敏度为0.170 ng/ml,线性测量范围为1.000～800.000 ng/ml。抗原类似物间无交叉反应。Cry1B毒蛋白质在大米中添加回收的批内变异系数为3.8%～6.6%、平均回收率为80.5%～84.8%,批间变异系数为2.2%～8.5%、平均回收率为84.1%～88.4%。表明本试验建立的双抗夹心Cry1B-TRFIA检测范围宽,特异性强,重复性和稳定性好。